चिकन भ्रूण में इनट्रेसलोमिक प्रत्यारोपण के माध्यम से किडनी ऑर्गेनोइड्स का कुशल वैस्कुलराइजेशन
Summary
यहां, हम चिकन भ्रूण के सेलोमिक गुहा में किडनी ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि 8 दिनों के भीतर ऑर्गेनोइड्स के वैस्कुलराइजेशन और बढ़ी हुई परिपक्वता को प्रेरित करती है और इन प्रक्रियाओं का कुशल तरीके से अध्ययन करने के लिए उपयोग की जा सकती है।
Abstract
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त किडनी ऑर्गेनोइड्स में नेफ्रॉन जैसी संरचनाएं होती हैं जो एक निश्चित डिग्री तक वयस्क गुर्दे से मिलती-जुलती होती हैं। दुर्भाग्य से, उनकी नैदानिक प्रयोज्यता एक कार्यात्मक वाहिका की कमी और परिणामस्वरूप विट्रो में सीमित परिपक्वता से बाधित होती है। चिकन भ्रूण के सेलोमिक गुहा में गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स का प्रत्यारोपण ग्लोमेरुलर केशिकाओं के गठन सहित संक्रमित रक्त वाहिकाओं द्वारा वैस्कुलराइजेशन को प्रेरित करता है, और उनकी परिपक्वता को बढ़ाता है। यह तकनीक बहुत कुशल है, जिससे बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण और विश्लेषण की अनुमति मिलती है। यह पेपर चिकन भ्रूण में किडनी ऑर्गेनोइड्स के इंट्रासेलोमिक प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, इसके बाद फ्लोरोसेंटली लेबल लेक्टिन का इंजेक्शन होता है ताकि संक्रमित वाहिका को दाग दिया जा सके, और इमेजिंग विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स का संग्रह। इस विधि का उपयोग इन प्रक्रियाओं को बढ़ाने और रोग मॉडलिंग में सुधार के लिए सुराग खोजने के लिए ऑर्गनॉइड वैस्कुलराइजेशन और परिपक्वता को प्रेरित करने और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) -व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स को विकासात्मक अध्ययन 1,2,3,4, विषाक्तता स्क्रीनिंग 5,6, और रोग मॉडलिंग5,7,8,9,10,11,12,13 के लिए क्षमता दिखाया गया है।. हालांकि, इन और अंतिम नैदानिक प्रत्यारोपण उद्देश्यों के लिए उनकी प्रयोज्यता संवहनी नेटवर्क की कमी से सीमित है। भ्रूण के गुर्दे के विकास के दौरान, पोडोसाइट्स, मेसांगियल कोशिकाएं और संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) ग्लोमेरुलस की जटिल संरचना बनाने के लिए बातचीत करती हैं। इस बातचीत के बिना, ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा, जिसमें पोडोसाइट्स, ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली (जीबीएम), और ईसी शामिल हैं, ठीक से विकसित नहीं हो सकते हैं। हालांकि इन विट्रो में किडनी ऑर्गेनोइड्स में कुछ ईसीएस होते हैं, ये एक उचित संवहनी नेटवर्क बनाने में विफल रहते हैं और समयके साथ कम हो जाते हैं। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि ऑर्गेनोइड अपरिपक्व रहते हैं। चूहों में प्रत्यारोपण गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स 18,19,20,21 के वैस्कुलराइजेशन और परिपक्वता को प्रेरित करता है। दुर्भाग्य से, यह एक श्रम-गहन प्रक्रिया है जो बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड ्स के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है।
चिकन भ्रूण का उपयोग एक सदी से अधिक समय से वैस्कुलराइजेशन और विकास का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। वे आसानी से सुलभ हैं, कम रखरखाव की आवश्यकता होती है, पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है, और अंडे के खोल 23,24,25,26 को खोलने के बाद सामान्य रूप से विकसित हो सकते हैं। उनके कोरियोलांटोइक झिल्ली (सीएएम) पर ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण को वैस्कुलराइजेशन27 का कारण दिखाया गया है। हालांकि, सीएएम पर प्रत्यारोपण की अवधि, साथ ही ग्राफ्ट की परिपक्वता का स्तर, सीएएम गठन द्वारा सीमित है, जिसे पूरा होने में भ्रूण के दिन 7 तक का समय लगता है। इसलिए, चिकन भ्रूण28 में इंट्रासेलोमिक प्रत्यारोपण के माध्यम से कुशलतापूर्वक संवहनी और परिपक्व किडनी ऑर्गेनोइड्स के लिए एक विधि हाल ही में विकसित की गई थी। चिकन भ्रूण की सेलोमिक गुहा 1930 के दशक से भ्रूण के ऊतकों29,30 के भेदभाव के लिए एक अनुकूल वातावरण के रूप में जानी जाती है। यह भ्रूण के विकास में जल्दी पहुँचा जा सकता है और सभी दिशाओं में ग्राफ्ट के अपेक्षाकृत असीमित विस्तार की अनुमति देता है।
यह पेपर दिन 4 चिकन भ्रूण के सेलोमिक गुहा में एचआईपीएस-व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है। यह विधि 8 दिनों के भीतर ऑर्गेनोइड्स के वैस्कुलराइजेशन और बढ़ी हुई परिपक्वता को प्रेरित करती है। भ्रूण का त्याग करने से पहले फ्लोरोसेंटली लेबल लेंस कलिनेरिस एग्लूटीनिन (एलसीए) का इंजेक्शन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ऑर्गेनोइड्स के भीतर संक्रमित रक्त वाहिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, चिकन भ्रूण में एचआईपीएससी-व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स के इनट्रैसेलोमिक प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया है। प्रत्यारोपण पर, ऑर्गेनोइड्स को संक्रमित रक्त वाह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चिकन भ्रूण इंजेक्शन के साथ उनकी मदद के लिए जॉर्ज गैलारिस (एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड) को धन्यवाद देते हैं। हम सास्किया वैन डेर वाल-मास (एनाटॉमी और भ्रूण विज्ञान विभाग, एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड), कोनी वैन मुंस्टरेन (एनाटॉमी और भ्रूणविज्ञान विभाग, एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड), मैनन ज़ुरमंड (एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड), और एनेमेरी डी ग्राफ (एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। M. Koning is is of ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. यह काम लीडेन यूनिवर्सिटी फंड “प्रोफेसर जाप डी ग्रेफ-लिंगलिंग वियाधनर्मा फंड” जीडब्ल्यूएफ 2019-02 द्वारा समर्थित था। यह काम पुनर्योजी चिकित्सा क्रॉसिंग बॉर्डर्स (RegMedXB) और हेल्थ हॉलैंड, टॉप सेक्टर लाइफ साइंसेज एंड हेल्थ के भागीदारों द्वारा समर्थित है। वैन डेन बर्ग और टीजे राबेलिंक को नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर स्टेम सेल मेडिसिन (आरईन्यू) द्वारा समर्थित किया जाता है, नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर स्टेम सेल मेडिसिन नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन अनुदान (एनएनएफ 21सीसी0073729) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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