Her presenterer vi en detaljert protokoll for transplantasjon av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager og kan brukes til å studere disse prosessene på en effektiv måte.
Nyreorganoider avledet fra humane induserte pluripotente stamceller inneholder nefronlignende strukturer som ligner de i den voksne nyren til en viss grad. Dessverre hemmes deres kliniske anvendelighet av mangelen på en funksjonell vaskulatur og følgelig begrenset modning in vitro. Transplantasjonen av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer induserer vaskularisering av perfuserte blodkar, inkludert dannelsen av glomerulære kapillærer, og forbedrer modningen. Denne teknikken er svært effektiv, noe som muliggjør transplantasjon og analyse av et stort antall organoider. Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for intracelomisk transplantasjon av nyreorganoider i kyllingembryoer, etterfulgt av injeksjon av fluorescerende merket lektin for å flekke den perfuserte vaskulaturen, og samlingen av transplanterte organoider for avbildningsanalyse. Denne metoden kan brukes til å indusere og studere organoid vaskularisering og modning for å finne ledetråder for å forbedre disse prosessene in vitro og forbedre sykdomsmodellering.
Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC)-avledede nyreorganoider har vist seg å ha potensial for utviklingsstudier 1,2,3,4, toksisitetsscreening 5,6 og sykdomsmodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Imidlertid er deres anvendelighet for disse og eventuelle kliniske transplantasjonsformål begrenset av mangelen på et vaskulært nettverk. Under embryonal nyreutvikling samhandler podocytter, mesangialceller og vaskulære endotelceller (EC) for å danne den intrikate strukturen til glomerulus. Uten denne interaksjonen kan den glomerulære filtreringsbarrieren, bestående av podocytter, den glomerulære kjellermembranen (GBM) og ECs, ikke utvikle seg riktig14,15,16. Selv om nyreorganoider in vitro inneholder noen EC, klarer disse ikke å danne et skikkelig vaskulært nettverk og avtar over tid17. Det er derfor ikke overraskende at organoidene forblir umodne. Transplantasjon hos mus induserer vaskularisering og modning av nyreorganoider 18,19,20,21. Dessverre er dette en arbeidsintensiv prosess som er uegnet for analyse av et stort antall organoider.
Kyllingembryoer har blitt brukt til å studere vaskularisering og utvikling i over et århundre22. De er lett tilgjengelige, krever lite vedlikehold, mangler et fullt funksjonelt immunsystem, og kan utvikle seg normalt etter åpning av eggeskallet23,24,25,26. Transplantasjon av organoider på deres chorioallantoic membran (CAM) har vist seg å føre til vaskularisering27. Imidlertid er varigheten av transplantasjonen på CAM, så vel som nivået av modning av transplantatet, begrenset av CAM-dannelse, som tar til embryonal dag 7 for å fullføre. Derfor ble det nylig utviklet en metode for effektivt å vaskularisere og modne nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer28. Det celomiske hulrommet av kyllingembryoer har vært kjent siden 1930-tallet for å være et gunstig miljø for differensiering av embryonale vev 29,30. Det kan nås tidlig i embryonal utvikling og muliggjør relativt ubegrenset utvidelse av transplantatet i alle retninger.
Denne artikkelen skisserer en protokoll for transplantasjon av hiPSC-avledede nyreorganoider i det celomiske hulrommet på dag 4 kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager. Injeksjon av fluorescerende merket linse culinaris agglutinin (LCA) før ofring av embryoene muliggjør visualisering av perfuserte blodkar i organoider gjennom konfokal mikroskopi.
I dette manuskriptet er det vist en protokoll for intracelomisk transplantasjon av hiPSC-deriverte nyreorganoider i kyllingembryoer. Ved transplantasjon vaskulariseres organoider av perfuserte blodkar som består av en kombinasjon av humane organoidavledede og kyllingavledede ECer. Disse er spredt over hele organoid og invaderer glomerulære strukturer, noe som muliggjør interaksjon mellom ECs og podocytter. Det er tidligere vist at dette fører til økt modning av organoide, glomerulære og rørformede strukturer<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker George Galaris (LUMC, Leiden, Nederland) for hans hjelp med kyllingembryoinjeksjon. Vi takker støtten fra Saskia van der Wal-Maas (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) og Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning støttes av ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. Dette arbeidet ble delvis støttet av Leiden University Fund “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02. Dette arbeidet støttes av partnerne til Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) og Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health. C.W. van den Berg og T.J. Rabelink støttes av The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine støttes av tilskudd fra Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |