मानव चिकित्सा के लिए एक अभिनव ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि के साथ मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति
Summary
सेल थेरेपी तैयारी / हेरफेर चरणों में पेश किए गए ज़ेनोजेनिक (रासायनिक या पशु-व्युत्पन्न) उत्पाद मेजबान रोगियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रोगजनक संचरण के बढ़ते जोखिम से जुड़े हैं। यहां, मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो विस्तार के लिए एक पूर्ण ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि का वर्णन किया गया है।
Abstract
स्टेम सेल थेरेपी के बढ़ते प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, इन विट्रो हेरफेर के दौरान पशु-व्युत्पन्न उत्पादों की शुरूआत के कारण संभावित संदूषण या संक्रमण संचरण के बारे में जैव सुरक्षा चिंताओं को उठाया गया है। ज़ेनोजेनिक घटक, जैसे कोलेजनेज या भ्रूण गोजातीय सीरम, आमतौर पर सेल अलगाव और विस्तार चरणों के दौरान उपयोग किए जाते हैं, जो प्राप्त रोगियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या वायरल, बैक्टीरियल और प्रियन संक्रमण के संभावित जोखिमों से जुड़े हो सकते हैं। अच्छे विनिर्माण अभ्यास दिशानिर्देशों के बाद, रासायनिक ऊतक पृथक्करण से बचा जाना चाहिए, जबकि भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को ज़ेनोजेनिक-मुक्त पूरक के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, सेल उत्पादों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों की परिभाषा महत्वपूर्ण है। हमने कोलेजनेज एफबीएस-सुसंस्कृत मानक प्रोटोकॉल की तुलना में मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो विस्तार के लिए एक अभिनव, पूरी तरह से ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि विकसित की है। यहां, मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एचएएससी) को पेट के वसा ऊतक से अलग किया गया था। नमूने को यांत्रिक रूप से कैंची / स्केलपेल के साथ काटा गया था, सूक्ष्म-विच्छेदित और यांत्रिक रूप से 10 सेमी पेट्री डिश में फैलाया गया था, और ऊतक के टुकड़ों के लगाव और एचएएससी के प्रवास को सुविधाजनक बनाने के लिए स्केलपेल चीरों के साथ तैयार किया गया था। धोने के चरणों के बाद, एंजाइमेटिक पाचन के बिना उनके प्लास्टिक पालन के कारण एचएएससी का चयन किया गया था। पृथक एचएएससी को 5% हेपरिन-मुक्त मानव प्लेटलेट लाइसेट के साथ पूरक माध्यम के साथ सुसंस्कृत किया गया था और पशु-मुक्त ट्रिप्सिन विकल्प के साथ अलग किया गया था। मानव चिकित्सा के लिए लक्षित सेल उत्पादों के उत्पादन पर अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) निर्देशों के बाद, किसी भी संस्कृति मीडिया में किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग नहीं किया गया था।
Introduction
पिछले दशकों में, अभिनव चिकित्सीय उपचारों की बढ़ती मांग ने ट्रांसलेशनल चिकित्सा क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रयासों और संसाधन निवेश को जन्म दियाहै। सेल-आधारित उत्पाद सेल स्रोत, विनिर्माण प्रक्रिया (अलगाव, विस्तार, या आनुवंशिक संशोधन), और गैर-सेलुलर पूरक (एंजाइम, विकास कारक, संस्कृति की खुराक और एंटीबायोटिक्स) द्वारा निर्धारित जोखिमों से जुड़े होते हैं, और ये जोखिम कारक विशिष्ट चिकित्सीय संकेत पर निर्भर करते हैं। अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता, सुरक्षा और प्रभावकारिता उपरोक्त संकेतित तत्वों से गहराई से प्रभावित हो सकतीहै। स्टेम सेल थेरेपी के लिए जैव सुरक्षा सिद्धांतों के पालन की आवश्यकता होती है; सेल संस्कृति में पशु-व्युत्पन्न उत्पादों के साथ रोगजनक संचरण के संभावित जोखिम समस्याग्रस्त हो सकते हैं, और विनिर्माण में पेश किए गए किसी भी उत्पाद का गहनपरीक्षण आवश्यक है।
मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एचएएससी) को अलग करने की पारंपरिक विधि में कोलेजनेज के साथ किया जाने वाला एक एंजाइमेटिक पाचन शामिल है, जिसके बाद सेंट्रीफ्यूजेशन 4 के माध्यम से धोने के चरणशामिल हैं। जबकि एंजाइमेटिक अलगाव को आमतौर पर सेल पैदावार और व्यवहार्यता के मामले में अन्य यांत्रिक तकनीकों की तुलना में अधिक कुशल माना जाता है, उपयोग किए जाने वाले पशु-व्युत्पन्न घटक, जैसे कोलेजनेज, को अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा न्यूनतम हेरफेर से अधिक माना जाता है। इसका मतलब है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं या रोग संचरण का काफी खतरा बढ़ जाता है, इस प्रकार एचएएससी थेरेपी के अनुवाद को नैदानिक सेटिंग्स 5,6 तक सीमित कर दिया जाता है।
ट्रिप्सिन-आधारित पाचन एएससी को अलग करने के लिए एक और एंजाइमेटिक प्रोटोकॉल है। ट्रिप्सिन एकाग्रता, सेंट्रीफ्यूजेशन गति और इनक्यूबेशन समय के संदर्भ में मामूली संशोधनों के साथ विभिन्न तकनीकों का वर्णन किया गया है। दुर्भाग्य से, इस विधि को अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है, और साहित्य में तुलना की कमी मौजूद है, खासकर यांत्रिक अलगाव प्रोटोकॉल7 के साथ। हालांकि, दृष्टिकोण की ट्रांसलैटेबिलिटी के संदर्भ में, ट्रिप्सिन में कोलेजनेज की समान कमियां हैं।
यांत्रिक बलों के आधार पर और एंजाइम जोड़ के बिना एएससी प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक अलगाव विधियों में वसा ऊतक के टुकड़े के उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन (800 x g या 1,280 x g, 15 मिनट) शामिल हैं। फिर, गोली को लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (5 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, इसके बाद कल्चर माध्यम में पुन: निलंबन से पहले 600 x g पर एक और सेंट्रीफ्यूजेशन चरण होता है। खोज विधियों की तुलना में पहले दिनों में कोशिकाओं की अधिक संख्या को अलग करने के बावजूद, एक पिछले अध्ययन ने संस्कृति8 के दूसरे सप्ताह से परे कम या अनुपस्थित प्रसार दिखाया।
इसके अलावा, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जैसे ज़ेनोजेनिक जोड़े गए माध्यम के साथ आगे हेरफेर, जिसे सेल कल्चर के लिए विकास कारक पूरक के रूप में उपयोग किया जाता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बढ़ते जोखिम और मेजबान रोगी 9,10 के वायरल, बैक्टीरियल या प्रियन संक्रमणके संपर्क में आने से जुड़ा हुआ है। एफबीएस11 के साथ उत्पादित मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की कई खुराक प्राप्त करने वाले व्यक्तियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और अर्टिकारीफॉर्म रैश विकास का वर्णन पहले से ही किया गया है। इसके अलावा, एफबीएस बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता के अधीन है, जिसका अंतिम उत्पाद गुणवत्ता 12 पर प्रभाव पड़सकता है।
अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) दिशानिर्देशों के अनुसार, एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण से बचा जाना चाहिए, और एफबीएस को ज़ेनोजेनिक-मुक्त पूरक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। ये कदम, अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल के साथ, सेल थेरेपी3,13 के आवेदन का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं।
इस संदर्भ में, मानव प्लेटलेट लाइसेट (एचपीएल) को एफबीएस के विकल्प के रूप में सुझाया गया है क्योंकि यह एक सेल-मुक्त, प्रोटीन युक्त, विकास कारक-समृद्ध पूरक है, और इसे पहले नैदानिक-ग्रेड सेल-आधारित उत्पादों के बीच इन विट्रो सेल संस्कृति और विस्तार14,15 के लिए विकास माध्यम के योजक के रूप में पेश किया गया था। चूंकि एचपीएल एक मानव-व्युत्पन्न उत्पाद है, इसलिए इसे अक्सर नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एचएएससी की इन विट्रो संस्कृति के दौरान एफबीएस के विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है, इस प्रकार प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं और एफबीएस ट्रांसलैटेबिलिटीसे संबंधित संक्रमणों के बारे में मुद्दों को कम किया जाता है।
उच्च उत्पादन लागत के बावजूद, यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया है कि एफबीएस की तुलना में, एचपीएल कई सेल प्रकारों के लिए सेल व्यवहार्यता का समर्थन करता है, प्रसार बढ़ाता है, शिथिलता में देरी करता है, जीनोमिक स्थिरता का आश्वासन देता है, और देर से सेल मार्ग में भी सेलुलर इम्यूनोफेनोटाइप का संरक्षण करता है; ये सभी तत्व इस संस्कृति पूरक11 की ओर स्विच करने का समर्थन करते हैं।
इस काम का उद्देश्य शास्त्रीय एफबीएस-सुसंस्कृत एचएएससी (चित्रा 1) की तुलना में सेल फिजियोलॉजी और स्टेमनेस गुणों को संशोधित किए बिना, एक पूर्ण पशु-मुक्त विधि के साथ एचएएससी को अलग करने और कल्चर करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित करना था।
Protocol
Representative Results
Discussion
वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं ने पिछले दशक में अपनी प्रचुरता, त्वरित और किफायती अलगाव विधियों, उच्च इन विट्रो / इन विवो प्रसार दर, और स्टेमनेस / भेदभावगुणों 18,19,20</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के पास कोई स्वीकृति नहीं है।
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
