Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana
Summary
Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.
Abstract
Considerando o crescente impacto da terapia com células-tronco, preocupações de biossegurança têm sido levantadas em relação à potencial contaminação ou transmissão de infecção devido à introdução de produtos derivados de animais durante a manipulação in vitro . Os componentes xenogênicos, como colagenase ou soro fetal bovino, comumente usados durante as etapas de isolamento e expansão celular podem estar associados aos riscos potenciais de reatividade imunológica ou infecção viral, bacteriana e príon nos pacientes receptores. Seguindo as diretrizes de boas práticas de fabricação, a dissociação química do tecido deve ser evitada, enquanto o soro fetal bovino (FBS) pode ser substituído por suplementos livres de xenogenes. Além disso, para garantir a segurança dos produtos celulares, é importante a definição de métodos mais fiáveis e reprodutíveis. Desenvolvemos um método inovador, completamente livre de xenogenes, para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sem alterar suas propriedades em comparação com os protocolos padrão cultivados com colagenase FBS. Aqui, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram isoladas do tecido adiposo abdominal. A amostra foi picada mecanicamente com tesoura/bisturi, microdissecada e dispersa mecanicamente em placa de Petri de 10 cm e preparada com incisões de bisturi para facilitar a fixação dos fragmentos de tecido e a migração de hASCs. Seguindo as etapas de lavagem, os hASCs foram selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática. Os hASCs isolados foram cultivados com meio suplementado com lisado plaquetário humano livre de heparina a 5% e destacados com um substituto de tripsina livre de animais. Seguindo as instruções das boas práticas de fabrico (BPF) sobre a produção de produtos celulares destinados à terapia humana, não foram utilizados antibióticos em nenhum meio de cultura.
Introduction
Nas últimas décadas, a crescente demanda por tratamentos terapêuticos inovadores deu origem a esforços significativos e investimentos em recursos no campo da medicina translacional1. Os produtos à base de células estão associados a riscos determinados pela fonte celular, pelo processo de fabricação (isolamento, expansão ou modificação genética) e pelos suplementos não celulares (enzimas, fatores de crescimento, suplementos de cultura e antibióticos), e esses fatores de risco dependem da indicação terapêutica específica. A qualidade, a segurança e a eficácia do produto final podem ser profundamente influenciadas pelos elementos acima indicados2. A terapia com células-tronco requer adesão aos princípios de biossegurança; os riscos potenciais de transmissão patogénica com produtos derivados de animais em cultura de células podem ser problemáticos, e o ensaio exaustivo de qualquer produto introduzido no fabrico é essencial3.
O método tradicional de isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) envolve uma digestão enzimática realizada com colagenase seguida de etapas de lavagem por centrifugação4. Embora o isolamento enzimático seja geralmente considerado mais eficiente do que outras técnicas mecânicas em termos de rendimento celular e viabilidade, os componentes derivados de animais usados, como a colagenase, são considerados mais do que minimamente manipulados pela Food and Drug Administration dos EUA. Isso significa que há um risco significativamente aumentado de reações imunes ou transmissão da doença, limitando a tradução da terapia com hASC para ambientes clínicos 5,6.
A digestão à base de tripsina é outro protocolo enzimático para isolar ASCs. Diferentes técnicas foram descritas com pequenas modificações em termos de concentração de tripsina, velocidade de centrifugação e tempo de incubação. Infelizmente, esse método não é bem descrito, e existe uma falta de comparação na literatura, particularmente com os protocolos de isolamento mecânico7. No entanto, em termos de traduzibilidade da abordagem, a tripsina tem as mesmas desvantagens da colagenase.
Métodos alternativos de isolamento para obtenção de ASCs, baseados em forças mecânicas e sem adição enzimática, envolvem centrifugação em alta velocidade (800 x g ou 1.280 x g, 15 min) dos fragmentos de tecido adiposo. Em seguida, o pellet é incubado com um tampão de lise de hemácias (5 min), seguido de outra etapa de centrifugação a 600 x g antes da ressuspensão em meio de cultura. Apesar de um maior número de células ter sido isolado nos primeiros dias em comparação com os métodos de explante, um estudo prévio mostrou menor ou ausente proliferação após a segunda semana de cultura8.
Além disso, a manipulação adicional com meio adicionado xenogênico, como o soro fetal bovino (FBS), que é utilizado como suplemento de fator de crescimento para cultura celular, está associada a um risco aumentado de reatividade imunológica e exposição a infecções virais, bacterianas ou priônicas do paciente hospedeiro 9,10. Reações imunes e desenvolvimento de erupções cutâneas urticariformes já foram descritas em indivíduos que receberam várias doses de células-tronco mesenquimais produzidas com FBS11. Além disso, a FBS está sujeita à variabilidade lote a lote, o que pode ter impacto na qualidade do produto final12.
De acordo com as diretrizes de boas práticas de fabricação (BPF), a dissociação do tecido enzimático deve ser evitada e a FBS deve ser substituída por suplementos livres de xenogenes. Essas etapas, aliadas a protocolos mais confiáveis e reprodutíveis, são essenciais para subsidiar a aplicação da terapia celular 3,13.
Nesse contexto, o lisado plaquetário humano (hPL) tem sido sugerido como um substituto para a FBS, uma vez que é um suplemento livre de células, contendo proteínas e enriquecido com fator de crescimento, e foi introduzido anteriormente entre produtos à base de células de grau clínico como aditivo de meio de crescimento para cultura e expansão celular in vitro 14,15. Como o hPL é um produto derivado de humanos, é frequentemente utilizado como substituto da FBS durante a cultura in vitro de hASCs destinadas a aplicações clínicas, reduzindo assim os problemas relacionados às reações imunológicas e infecções relacionadas à traduzibilidade da FBS15,16.
Apesar dos custos de produção mais elevados, já foi demonstrado que, em comparação com a FBS, o hPL suporta a viabilidade celular para muitos tipos de células, aumenta a proliferação, retarda a senescência, garante a estabilidade genômica e conserva o imunofenótipo celular mesmo em passagens celulares tardias; todos esses elementos sustentam a mudança para esse suplemento cultural11.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo padronizado para isolar e cultivar hASCs com um método completo livre de animais, sem modificar a fisiologia celular e as propriedades da caule em comparação com as hASCs clássicas cultivadas em FBS (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
As células-tronco derivadas de tecido adiposo têm atraído o interesse da pesquisa translacional na última década devido à sua abundância, métodos de isolamento rápidos e acessíveis, alta taxa de proliferação in vitro/in vivo e propriedades de caule/diferenciação18,19,20. Como resultado, as hASCs são consideradas um excelente candidato para estratégias baseadas em células em medicina regenerativ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm reconhecimentos.
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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