ヒト異種異系フリーのヒト治療法によるヒト脂肪由来幹細胞の単離と培養
Summary
細胞療法の準備/操作ステップで導入された異種(化学的または動物由来)製品は、宿主患者における免疫反応性および病原性伝播のリスクの増加と関連しています。ここでは、ヒト脂肪由来幹細胞の単離および in vitro 増殖のための完全な異種異系フリーの方法が記載されている。
Abstract
幹細胞治療の影響の増大を考慮して、 in vitro 操作中の動物由来製品の導入による潜在的な汚染または感染伝播に関してバイオセーフティの懸念が提起されています。細胞の単離および増殖ステップで一般的に使用されるコラゲナーゼやウシ胎児血清などの異種成分は、投与を受けた患者の免疫反応性またはウイルス、細菌、プリオン感染の潜在的なリスクに関連している可能性があります。適正製造基準のガイドラインに従って、化学的組織の解離は避ける必要がありますが、ウシ胎児血清(FBS)は異種を含まないサプリメントに置き換えることができます。さらに、細胞製品の安全性を確保するためには、より信頼性が高く再現性のある方法の定義が重要です。私たちは、コラゲナーゼFBS培養標準プロトコルと比較して、その特性を変えることなく、ヒト脂肪由来幹細胞の単離と in vitro 増殖のための革新的で完全に異種異系を含まない方法を開発しました。ここでは、腹部脂肪組織からヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を単離した。サンプルはハサミ/メスで機械的にミンチし、マイクロ解剖して10 cmのペトリ皿に機械的に分散させ、組織片の付着とhASCの移動を容易にするためにメスの切開で調製しました。洗浄ステップに続いて、酵素消化なしでプラスチックが付着するため、hASCが選択されました。単離したhASCを、5%ヘパリンフリーヒト血小板溶解物を添加した培地で培養し、動物を含まないトリプシン代替物で剥離しました。ヒト治療を目的とした細胞製品の製造に関する適正製造基準(GMP)の指示に従って、どの培地にも抗生物質は使用されていません。
Introduction
過去数十年で、革新的な治療法に対する需要の高まりにより、トランスレーショナルメディシン分野への多大な努力とリソース投資が発生しました1。細胞ベースの製品は、細胞源、製造プロセス(分離、増殖、または遺伝子組み換え)、および非細胞サプリメント(酵素、成長因子、培養サプリメント、および抗生物質)によって決定されるリスクと関連しており、これらの危険因子は特定の治療適応症に依存します。最終製品の品質、安全性、および有効性は、上記の要素2によって深く影響を受ける可能性があります。幹細胞治療は、バイオセーフティの原則を順守する必要があります。細胞培養における動物由来製品による病原性感染の潜在的なリスクは問題となる可能性があり、製造に導入された製品の徹底的なテストが不可欠です3。
ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を単離する従来の方法では、コラゲナーゼを用いた酵素消化とそれに続く遠心分離による洗浄ステップが行われます4。酵素による単離は、一般に、細胞収量と生存率の点で他の機械的技術よりも効率的であると考えられていますが、コラゲナーゼなど、使用される動物由来の成分は、米国食品医薬品局によって最小限に操作されていると考えられています。これは、免疫反応または疾患伝播のリスクが大幅に増加することを意味し、したがって、hASC療法の臨床現場への翻訳を制限します5,6。
トリプシンベースの消化は、ASCを単離するための別の酵素プロトコルです。トリプシン濃度、遠心分離速度、およびインキュベーション時間の点でわずかな変更を加えたさまざまな技術が説明されています。残念なことに、この方法は十分に説明されておらず、文献、特に機械的絶縁プロトコル7との比較の欠如が存在する。しかしながら、アプローチの翻訳可能性に関して、トリプシンはコラゲナーゼと同じ欠点を有する。
機械的な力に基づいて酵素を添加しないASCを得るための代替単離方法には、脂肪組織断片の高速遠心分離(800 x gまたは1,280 x g、15分)が含まれます。次いで、ペレットを赤血球溶解緩衝液(5分間)と共にインキュベートし、続いて培養培地に再懸濁する前に600 x gで別の遠心分離工程を行う。外植片法と比較して最初の数日間に単離された細胞の数が多いにもかかわらず、以前の研究では、培養2週目以降の増殖が少ないか、または存在しないことが示されました8。
それに加えて、細胞培養のための成長因子サプリメントとして使用されるウシ胎児血清(FBS)などの異種添加培地によるさらなる操作は、免疫反応性のリスクおよび宿主患者のウイルス、細菌、またはプリオン感染への曝露の増加と関連している9,10。免疫反応および蕁麻疹様発疹の発生は、FBS11で産生された間葉系幹細胞を数回投与された個体において既に説明されている。さらに、FBSはバッチ間のばらつきを受け、最終製品の品質に影響を与える可能性があります12。
適正製造基準(GMP)ガイドラインに従って、酵素組織の解離を回避し、FBSを異種を含まないサプリメントに置き換える必要があります。これらのステップは、より信頼性が高く再現性のあるプロトコルとともに、細胞療法の適用をサポートするために不可欠です3、13。
これに関連して、ヒト血小板ライセート(hPL)は、無細胞、タンパク質含有、成長因子が豊富なサプリメントであり、in vitro細胞培養および増殖のための増殖培地の添加剤として臨床グレードの細胞ベースの製品の間で以前に導入されたため、FBSの代替として提案されています14,15。hPLはヒト由来の産物であるため、臨床応用を目的としたhASCのin vitro培養中にFBSの代替として頻繁に使用され、FBSの翻訳可能性に関連する免疫反応や感染症に関する問題を軽減します15,16。
より高い生産コストにもかかわらず、FBSと比較して、hPLは多くの細胞タイプの細胞生存率をサポートし、増殖を増加させ、老化を遅らせ、ゲノム安定性を保証し、後期細胞継代でも細胞免疫表現型を保存することがすでに実証されています。これらすべての要素は、この文化サプリメント11への切り替えをサポートします。
この研究の目的は、従来のFBS培養hASCと比較して、細胞生理学とステムネスの特性を変更することなく、完全な動物を含まない方法でhASCを分離および培養するための標準化されたプロトコルを開発することでした(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂肪由来幹細胞は、その豊富さ、迅速で手頃な価格の単離方法、高いin vitro/in vivo増殖率、および幹細胞性/分化特性により、過去10年間でトランスレーショナル研究の関心を集めてきました18,19,20。その結果、hASCは再生医療における細胞ベースの戦略の優れた候補と考えられています21。脂肪…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者には謝辞がありません。
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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