عزل وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون بطريقة مبتكرة خالية من الجينات الخارجية للعلاج البشري
Summary
ترتبط المنتجات Xenogenec (الكيميائية أو المشتقة من الحيوانات) التي يتم إدخالها في خطوات تحضير / معالجة العلاج بالخلايا بزيادة خطر التفاعل المناعي وانتقال مسببات الأمراض في المرضى المضيفين. هنا ، يتم وصف طريقة كاملة خالية من xenogenec لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون في المختبر .
Abstract
وبالنظر إلى التأثير المتزايد للعلاج بالخلايا الجذعية، أثيرت شواغل تتعلق بالسلامة البيولوجية فيما يتعلق بالتلوث المحتمل أو انتقال العدوى بسبب إدخال المنتجات المشتقة من الحيوانات أثناء التلاعب في المختبر . يمكن أن ترتبط المكونات الغريبة ، مثل كولاجيناز أو مصل الجنين البقري ، الذي يشيع استخدامه أثناء عزل الخلايا وخطوات التوسع بالمخاطر المحتملة للتفاعل المناعي أو العدوى الفيروسية والبكتيرية والبريون في المرضى المستقبلين. باتباع إرشادات ممارسات التصنيع الجيدة ، يجب تجنب تفكك الأنسجة الكيميائية ، بينما يمكن استبدال مصل الأبقار الجنيني (FBS) بمكملات خالية من الزينوجينيك. علاوة على ذلك ، لضمان سلامة المنتجات الخلوية ، من المهم تحديد طرق أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. لقد طورنا طريقة مبتكرة وخالية تماما من الزينوجينيا لعزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون وتوسيعها في المختبر دون تغيير خصائصها مقارنة بالبروتوكولات القياسية المستزرعة بالكولاجيناز FBS. هنا ، تم عزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (hASCs) من الأنسجة الدهنية البطنية. تم فرم العينة ميكانيكيا بمقص / مشرط ، وتم تشريحها بدقة وتشتيتها ميكانيكيا في طبق بتري 10 سم ، وتحضيرها بشقوق مشرط لتسهيل ربط شظايا الأنسجة وهجرة hASCs. بعد خطوات الغسيل ، تم اختيار hASCs بسبب التصاق البلاستيك دون هضم إنزيمي. تم استزراع hASCs المعزولة بوسط مكمل بمحلول الصفائح الدموية البشري الخالي من الهيبارين بنسبة 5٪ وفصله ببديل التربسين الخالي من الحيوانات. باتباع توجيهات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) بشأن إنتاج منتجات الخلايا المخصصة للعلاج البشري ، لم يتم استخدام أي مضادات حيوية في أي وسائط ثقافية.
Introduction
في العقود الماضية ، أدى الطلب المتزايد على العلاجات العلاجية المبتكرة إلى بذل جهود كبيرة واستثمار الموارد في مجال الطب الانتقالي1. ترتبط المنتجات القائمة على الخلايا بالمخاطر التي يحددها مصدر الخلية ، وعملية التصنيع (العزل ، أو التوسع ، أو التعديل الوراثي) ، والمكملات غير الخلوية (الإنزيمات ، وعوامل النمو ، ومكملات الثقافة ، والمضادات الحيوية) ، وتعتمد عوامل الخطر هذه على المؤشر العلاجي المحدد. يمكن أن تتأثر جودة وسلامة وفعالية المنتج النهائي بعمق بالعناصر المشار إليها أعلاه2. يتطلب العلاج بالخلايا الجذعية الالتزام بمبادئ السلامة البيولوجية. يمكن أن تكون المخاطر المحتملة لانتقال مسببات الأمراض مع المنتجات المشتقة من الحيوانات في زراعة الخلايا مشكلة ، والاختبار الشامل لأي منتج يتم إدخاله في التصنيع ضروري3.
تتضمن الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (hASCs) عملية هضم إنزيمية يتم إجراؤها باستخدام كولاجيناز تليها خطوات غسيل من خلال الطرد المركزي4. في حين أن العزل الأنزيمي يعتبر عموما أكثر كفاءة من التقنيات الميكانيكية الأخرى من حيث غلة الخلايا وصلاحيتها ، فإن المكونات المشتقة من الحيوانات المستخدمة ، مثل الكولاجين ، تعتبر أكثر من الحد الأدنى من التلاعب بها من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. هذا يعني أن هناك خطرا متزايدا بشكل كبير من ردود الفعل المناعية أو انتقال المرض ، مما يحد من ترجمة علاج hASC إلى الإعدادات السريرية 5,6.
الهضم القائم على التربسين هو بروتوكول إنزيمي آخر لعزل ASCs. تم وصف تقنيات مختلفة مع تعديلات طفيفة من حيث تركيز التربسين وسرعة الطرد المركزي ووقت الحضانة. لسوء الحظ ، لم يتم وصف هذه الطريقة بشكل جيد ، ويوجد نقص في المقارنة في الأدبيات ، لا سيما مع بروتوكولات العزل الميكانيكية7. ومع ذلك ، من حيث قابلية ترجمة النهج ، فإن التربسين له نفس عيوب الكولاجيناز.
تتضمن طرق العزل البديلة للحصول على ASCs ، بناء على القوى الميكانيكية وبدون إضافة إنزيم ، الطرد المركزي عالي السرعة (800 × جم أو 1280 × جم ، 15 دقيقة) لشظايا الأنسجة الدهنية. بعد ذلك ، يتم تحضين الحبيبات بمخزن مؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (5 دقائق) ، تليها خطوة طرد مركزي أخرى عند 600 × جم قبل إعادة التعليق في وسط الاستزراع. على الرغم من وجود عدد أكبر من الخلايا التي تم عزلها في الأيام الأولى مقارنة بطرق الزرع ، أظهرت دراسة سابقة انتشارا أقل أو غائبا بعد الأسبوع الثاني من الثقافة8.
إلى جانب ذلك ، يرتبط المزيد من التلاعب بالوسط المضاف xenogenec ، مثل مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، والذي يستخدم كمكمل لعامل النمو لزراعة الخلايا ، بزيادة خطر التفاعل المناعي والتعرض للعدوى الفيروسية أو البكتيرية أو البريون للمريض المضيف 9,10. تم بالفعل وصف ردود الفعل المناعية وتطور الطفح الجلدي الشروي في الأفراد الذين يتلقون عدة جرعات من الخلايا الجذعية الوسيطة المنتجة باستخدام FBS11. علاوة على ذلك، تخضع FBS لتقلبات من دفعة إلى أخرى، والتي يمكن أن يكون لها تأثير على جودة المنتج النهائي12.
وفقا لإرشادات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، يجب تجنب تفكك الأنسجة الأنزيمية ، ويجب استبدال FBS بمكملات خالية من الجينات. هذه الخطوات ، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات أكثر موثوقية وقابلة للتكرار ، ضرورية لدعم تطبيق العلاج الخلوي 3,13.
في هذا السياق ، تم اقتراح تحلل الصفائح الدموية البشرية (hPL) كبديل ل FBS لأنه مكمل خال من الخلايا ويحتوي على البروتين وغني بعامل النمو ، وقد تم تقديمه سابقا بين المنتجات القائمة على الخلايا السريرية كمادة مضافة لوسط النمو لزراعة الخلايا في المختبر والتوسع14,15. نظرا لأن hPL منتج مشتق من الإنسان ، فإنه يستخدم بشكل متكرر كبديل ل FBS أثناء الثقافة المختبرية ل hASCs المخصصة للتطبيقات السريرية ، وبالتالي تقليل المشكلات المتعلقة بالتفاعلات المناعية والالتهابات المتعلقة بقابلية ترجمة FBS15,16.
على الرغم من ارتفاع تكاليف الإنتاج ، فقد ثبت بالفعل أنه بالمقارنة مع FBS ، فإن hPL يدعم صلاحية الخلية للعديد من أنواع الخلايا ، ويزيد من الانتشار ، ويؤخر الشيخوخة ، ويضمن الاستقرار الجيني ، ويحافظ على النمط المناعي الخلوي حتى في ممرات الخلايا المتأخرة. كل هذه العناصر تدعم التحول نحو ملحق الثقافةهذا 11.
كان الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول موحد لعزل وزراعة hASCs بطريقة كاملة خالية من الحيوانات ، دون تعديل فسيولوجيا الخلية وخصائص الجذعية مقارنة ب hASCs التقليدية المستزرعة FBS (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
جذبت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون اهتمام الأبحاث الانتقالية في العقد الماضي بسبب وفرتها ، وطرق عزلها السريعة وبأسعار معقولة ، وارتفاع معدل الانتشار في المختبر / في الجسم الحي ، وخصائص الجذعية / التمايز18،19،20. نتيجة لذلك ، ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ليس لدى المؤلفين أي اعترافات.
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
