Summary
Este protocolo describe el ensayo de alimentación obligada para evaluar el efecto potencialmente tóxico de un fitoquímico en las larvas de insectos lepidópteros. Este es un bioensayo de insectos altamente escalable, fácil de optimizar la dosis subletal y letal, la actividad disuasoria y el efecto fisiológico. Esto podría usarse para detectar insecticidas ecológicos.
Abstract
Helicoverpa armigera, un insecto lepidóptero, es una plaga polífaga con una distribución mundial. Este insecto herbívoro es una amenaza para las plantas y la productividad agrícola. En respuesta, las plantas producen varios fitoquímicos que afectan negativamente el crecimiento y la supervivencia del insecto. Este protocolo demuestra un método de ensayo de alimentación obligado para evaluar el efecto de un fitoquímico (quercetina) en el crecimiento, desarrollo y supervivencia de los insectos. En condiciones controladas, los neonatos se mantuvieron hasta el segundo estadio con una dieta artificial predefinida. A estas larvas de segundo estadio se les permitió alimentarse con una dieta artificial de control y que contenía quercetina durante 10 días. El peso corporal, la etapa de desarrollo, el peso de los excrementos y la mortalidad de los insectos se registraron en días alternos. El cambio en el peso corporal, la diferencia en el patrón de alimentación y los fenotipos de desarrollo se evaluaron a lo largo del tiempo de ensayo. El ensayo de alimentación obligatoria descrito simula un modo natural de ingestión y puede ampliarse a un gran número de insectos. Permite analizar el efecto de los fitoquímicos en la dinámica de crecimiento, la transición del desarrollo y la aptitud general de H. armigera. Además, esta configuración también se puede utilizar para evaluar alteraciones en los parámetros nutricionales y los procesos de fisiología digestiva. Este artículo proporciona una metodología detallada para los sistemas de ensayo de alimentación, que puede tener aplicaciones en estudios toxicológicos, detección de moléculas insecticidas y comprensión de los efectos químicos en las interacciones planta-insecto.
Introduction
Los factores bióticos que afectan la productividad de los cultivos son principalmente agentes patógenos y plagas. Varias plagas de insectos causan entre el 15% y el 35% de la pérdida de cultivos agrícolas y afectan las prácticas de sostenibilidad económica1. Los insectos pertenecientes a los órdenes Coleoptera, Hemiptera y Lepidoptera son los principales órdenes de plagas devastadoras. La naturaleza altamente adaptativa del medio ambiente ha beneficiado a los lepidópteros en la evolución de varios mecanismos de supervivencia. Entre los insectos lepidópteros, Helicoverpa armigera (gusano del algodón) puede alimentarse de alrededor de 180 cultivos diferentes y causar daños significativos a sus tejidos reproductivos2. A nivel mundial, la infestación por H. armigera ha provocado una pérdida de alrededor de5 mil millones de dólares. El algodón, los garbanzos, los gandules, los tomates, los girasoles y otros cultivos son huéspedes de H. armigera. Completa su ciclo de vida en diferentes partes de las plantas hospederas. Los huevos puestos por las polillas hembra eclosionan en las hojas, seguidos de su alimentación de tejidos vegetativos durante las etapas larvarias. La etapa larvaria es la más destructiva debido a su naturaleza voraz y altamente adaptable 4,5. H. armigera muestra una distribución global e invasión a nuevos territorios debido a sus notables atributos, como polifagia, excelentes capacidades migratorias, mayor fecundidad, fuerte diapausa y la aparición de resistencia a las estrategias de control de insectos existentes6.
Diversas moléculas químicas de terpenos, flavonoides, alcaloides, polifenoles, glucósidos cianogénicos y muchos otros son ampliamente utilizadas para el control de la infestación por H. armigera 7. Sin embargo, la aplicación frecuente de moléculas químicas tiene efectos adversos en el medio ambiente y la salud humana debido a la adquisición de sus residuos. Además, muestran un efecto perjudicial sobre varios depredadores de plagas, lo que resulta en un desequilibrio ecológico 8,9. Por lo tanto, existe la necesidad de investigar opciones seguras y ecológicas para las moléculas químicas de control de plagas.
Las moléculas insecticidas naturales producidas por las plantas (fitoquímicos) pueden utilizarse como una alternativa prometedora a los pesticidas químicos. Estos fitoquímicos incluyen varios metabolitos secundarios pertenecientes a las clases alcaloides, terpenoides y fenólicos 7,10. La quercetina es uno de los flavonoides (compuestos fenólicos) más abundantes presentes en diversos granos, verduras, frutas y hojas. Muestra actividad disuasoria de alimentación e insecticida contra insectos; Además, no es perjudicial para los enemigos naturales de las plagas11,12. Por lo tanto, este protocolo demuestra el ensayo de alimentación utilizando quercetina para evaluar su efecto tóxico sobre H. armigera.
Se han desarrollado varios métodos de bioensayo para evaluar el efecto de las moléculas naturales y sintéticas en los patrones de alimentación, crecimiento, desarrollo y comportamiento de un insecto13. Los métodos comúnmente utilizados incluyen el ensayo de disco foliar, el ensayo de alimentación de elección, el ensayo de alimentación por gotas, el ensayo de contacto, el ensayo de cobertura de la dieta y el ensayo de alimentación obligada13,14. Estos métodos se clasifican en función de cómo se aplican los pesticidas a los insectos. El ensayo de alimentación obligatoria es uno de los métodos más utilizados, sensibles, sencillos y adaptables para analizar los probables insecticidas y su dosis letal14. En un ensayo de alimentación obligada, la molécula de interés se mezcla con una dieta artificial. Esto proporciona consistencia y control sobre la composición de la dieta, generando resultados robustos y reproducibles. Las variables importantes que afectan a los ensayos de alimentación son la etapa de desarrollo del insecto, la elección del insecticida, los factores ambientales y el tamaño de la muestra. La duración del ensayo, el intervalo entre dos registros de datos, la frecuencia y la cantidad de dieta administrada, la salud de los insectos y la habilidad de manejo de los operadores también pueden influir en el resultado de los ensayos de alimentación14,15.
Este estudio tiene como objetivo demostrar el ensayo de alimentación obligada para evaluar el efecto de la quercetina sobre la supervivencia y aptitud física de H. armigera . La evaluación de varios parámetros, como el peso corporal de los insectos, la tasa de mortalidad y los defectos de desarrollo, proporcionará información sobre los efectos insecticidas de la quercetina. Mientras tanto, la medición de los parámetros nutricionales, incluida la eficiencia de conversión de los alimentos ingeridos (ECI), la eficiencia de conversión de los alimentos digeridos (ECD) y la digestibilidad aproximada (AD), destacará los atributos antialimentarios de la quercetina.
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Protocol
Las larvas de H. armigera fueron adquiridas en la Oficina Nacional de Recursos de Insectos Agrícolas (NBAIR, por sus siglas en inglés) del ICAR, Bangalore, India. Para el presente estudio se utilizaron un total de 21 larvas de segundo estadio.
1. Preparación de dieta artificial a base de garbanzos
NOTA: En la Tabla 1 se menciona una lista de los ingredientes necesarios para preparar una dieta artificial.
- Pesar todas las fracciones por separado en un vaso de precipitados, como se indica en la Tabla 1, y preparar una mezcla homogénea con una espátula/agitador magnético.
- Hervir la fracción C a unos 100 °C en el microondas durante 5 min, añadir a la fracción A y mezclar bien.
- Después de mezclar bien, deje que la fracción mezclada se enfríe un poco antes de agregar la fracción B (la fracción B contiene componentes termolábiles).
- Vierta en una placa de Petri de poliestireno transparente de 150 mm x 150 mm.
2. Preparación de una dieta artificial que contenga quercetina
- Pesar la cantidad adecuada (1.000 ppm) de hidrato de quercetina (ver Tabla de materiales) y disolverla adecuadamente en el volumen mínimo de disolventes orgánicos, como etanol (2 mg/mL), dimetilsulfóxido (DMSO; 30 mg/mL) o dimetilformamida (DMF). Aquí, el DMSO se utiliza para disolver la quercetina.
- Agregue quercetina disuelta a la fracción B, seguida de la adición a la mezcla de fracciones A y C (el volumen de agua reducido de la fracción B es igual al volumen de DMSO agregado).
- Agregue un volumen igual de solvente orgánico utilizado para disolver la quercetina en la dieta de control.
NOTA: La Figura 1 muestra la representación esquemática de la preparación de dietas artificiales y que contienen quercetina.
3. Cría y mantenimiento del cultivo de H. armigera
NOTA: Utilice materiales debidamente limpios y esterilizados para la cría y el mantenimiento de insectos. Manipule los insectos con cuidado siguiendo todas las prácticas operativas estándar relacionadas con la esterilidad y la seguridad 16,17,18.
- Mantener los huevos de H. armigera en la cámara de cría (frasco de plástico cubierto con tela de muselina) en condiciones mantenidas, como se describe en el paso 3.3. Luego, transfiera suavemente a los recién salidos con un pincel fino sobre una dieta artificial a base de garbanzos recién preparada.
- Use una dieta artificial para criar las larvas y una solución de sacarosa al 20% (p/v) con multivitamínico al 1% (p/v) (ver Tabla de Materiales) para polillas adultas19,20.
NOTA: Como las larvas de H . armigera en el tercer estadio y más antiguas muestran una tendencia caníbal, es necesario criar cada larva en un vial separado. - Mantener la temperatura a 25 ± 1 °C y la humedad relativa al 70% en la sala de cultivo de insectos, con un fotoperiodo de 16 h luz:8 h oscuro21.
- Cría una generación de insectos en el laboratorio para obtener homogeneidad y luego utilícela para el ensayo de alimentación.
- Opcionalmente, aumente la temperatura de la sala de cultivo de insectos a 28 °C para acelerar el crecimiento de larvas y pupas22.
4. Configuración para el ensayo de alimentación
- Recolectar 21 larvas de segundo estadio para cada serie (control y tratamiento) y mantenerlas alejadas de la dieta, durante aproximadamente 1-3 h.
- Corte la dieta de control y la que contiene quercetina en trozos pequeños, registre el peso de la dieta administrada y el cuerpo del insecto, y transfiera cuidadosamente los insectos a viales de cultivo. Permita que los insectos se alimenten de la dieta respectiva.
NOTA: Esto debe considerarse como el día 0 del ensayo de alimentación. - Registre el peso del cuerpo del insecto, la dieta dada, la dieta no consumida y los excrementos en días alternos (días 2, 4, 6, 8 y 10) hasta el décimo día de ensayo.
- Después del día 10, manténgalos alimentándose de su respectiva dieta para observar más cambios morfológicos y de desarrollo.
NOTA: El desarrollo cambia por medio de: (1) intermediarios larval-pupa, como la mitad posterior del cuerpo de las pupas con parches de cutícula larvaria, una cápsula en la cabeza y patas torácicas; (2) prepupas con el cuerpo completamente ennegrecido; (3) pupas de tamaño insuficiente con encogimiento del cuerpo; (4) polilla de la pupa polilla intermedia con la piel de la pupa vieja. Los cambios morfológicos incluyen polillas adultas malformadas con cuerpos anormales, alas retorcidas y patas articuladas. Estos cambios se comparan con los insectos alimentados con la dieta de control. - Congelar los insectos el día 10 si no se requiere el estudio de defectos de desarrollo y morfológicos.
NOTA: Antes de congelar las larvas, deben mantenerse privadas de la dieta durante al menos 3 h para eliminar la dieta residual del tracto digestivo.
5. Registro y análisis de datos
- En el software GraphPad Prism (consulte Tabla de materiales), elija una tabla de datos XY del cuadro de diálogo "Bienvenida o Nueva tabla" y, en ella, introduzca el número de insectos que replican los valores uno al lado del otro en las subcolumnas. A continuación, asigne el nombre del título al eje X como número de días y, en los grupos A y B, asigne el nombre del título como control y tratamiento con quercetina, respectivamente. Poner bajo control y tratamiento el peso corporal de cada insecto para generar la gráfica de peso corporal.
NOTA: El análisis en GraphPad puede variar según el tamaño de la muestra y el número de tratamientos. - Compare el peso corporal del insecto entre los grupos de control y tratamiento mediante una prueba t de Student (α = 0,05).
- Cuente las larvas y pupas vivas y muertas en el día 10 para trazar una curva de Kaplan-Meier para el porcentaje de supervivencia utilizando el software de gráficos.
- Cuente el número de pupas y calcule el porcentaje de pupas usando la fórmula dada:
- Porcentaje de pupación (%) = (número de pupas formadas/número total de larvas) x 100
- Compare el desarrollo larvario en términos de índices nutricionales23 utilizando las siguientes fórmulas, ECI (%) = (ganancia de peso de las larvas/peso del alimento consumido) x 100
ECD (%) = (aumento de peso de las larvas/[peso del alimento consumido - peso de los excrementos]) x 100
AD (%) = ([peso del alimento consumido - peso de los excrementos]/peso del alimento consumido) x 100
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Representative Results
Las larvas de insectos alimentadas con una dieta que contenía 1.000 ppm de quercetina mostraron una disminución significativa en el peso corporal de ~57% en comparación con el grupo de control (Figura 2A). La reducción del peso corporal dio lugar a una reducción del tamaño corporal de las larvas tratadas con quercetina (Figura 2B). Se observó una reducción notable en la tasa de alimentación de las larvas alimentadas con quercetina en comparación con el control (Figura 2C).
Además, las larvas alimentadas con quercetina mostraron una disminución en la tasa de pupación en ~14% y un retraso en la pupación, lo que sugiere un retraso en el desarrollo tras el tratamiento (Figura 3A, B). Además, ~77,65% de fenotipos letales y de supervivencia se observaron en larvas de insectos alimentadas con una dieta que contenía quercetina (Figura 4A, B). Se calcularon los parámetros nutricionales para las larvas control y alimentadas con quercetina en función del consumo y utilización de los alimentos (Tabla Suplementaria 1). El ECI a la materia corporal y el ECD para los insectos alimentados con la dieta de 1.000 ppm que contiene quercetina se redujeron en ~9 % y ~49 %, respectivamente. La disminución de la ECD puede deberse a la falta de metabolitos disponibles en el cuerpo del insecto20. La DA de los insectos alimentados con quercetina se incrementó en ~5% en comparación con el control (Tabla 2). En general, los resultados obtenidos indican que la quercetina tiene efectos negativos significativos sobre el crecimiento de insectos y el desarrollo de H. armigera.
Figura 1: Representación esquemática de la preparación de una dieta artificial y una dieta que contiene quercetina. Las fracciones A, B y C se mezclan para hacer una dieta artificial y que contiene quercetina. Las larvas se alimentan con la dieta respectiva durante 10 días. Las flechas azules de proceso representan una dieta artificial, mientras que las flechas de proceso rojas representan la preparación de una dieta que contiene quercetina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos representativos del ensayo de alimentación con quercetina. (A) Gráfico del peso corporal de las larvas de H. armigera después de la alimentación con 1.000 ppm de quercetina en comparación con el control en los días 2, 4, 6, 8 y 10. El peso corporal de las larvas se expresa en miligramos (mg). (B) El tamaño medio de las larvas se registra en el día 10. Barra de escala = 1 cm. (C) Tasa media de alimentación registrada en los días 2, 4, 6, 8 y 10. El peso del alimento se expresa en miligramos (mg). Los círculos azules y los cuadrados rojos representan los datos promedio de los insectos control y tratados con quercetina en días alternos, respectivamente. La prueba t de Student se utiliza para la comparación de los dos grupos (emparejados). Los datos representan la media ± SEM (n = 21 larvas de segundo estadio; *p < 0,05 indica estadísticamente significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos representativos de la pupación del ensayo de alimentación. (A) Gráfico de porcentaje de pupa. (B) Imágenes de pupas (Día 15) que muestran una tasa de pupación retrasada y reducida en el tratamiento con quercetina. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Datos representativos de supervivencia en el día 10 tras la alimentación con 1.000 ppm de quercetina en comparación con el control. (A) El gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier para insectos alimentados con quercetina indica una disminución de la tasa de supervivencia. Los insectos de control muestran una tasa de supervivencia de ~96%, y los insectos tratados con quercetina muestran una supervivencia de ~77,65%. (B) Imágenes de fenotipos letales de larvas alimentadas con quercetina tomadas el día 10. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fracción A | ||
| 1 | Gramo de Bengala | 50 g |
| 2 | Extracto de levadura | 12 g |
| 3 | Caseína | 3,5 g |
| 4 | Ácido sórbico | 0,5 g |
| 5 | Metilparabeno | 1 g |
| 6 | dH2O | 150 ml |
| Fracción B | ||
| 1 | Cloruro de colina | 0,35 g |
| 2 | Estreptomicina | 0,02 g |
| 3 | Ácido ascórbico | 2 g |
| 4 | Colesterol | 0,15 g |
| 5 | Cápsula multivitamínica | 1 |
| 6 | Cápsula de vitamina E | 1 |
| 7 | dH2O | 30 mL |
| Fracción C | ||
| 1 | Agar Agar | 6,5 g |
| 2 | dH2O | 180 ml |
Tabla 1: Composición de la dieta artificial.
| Tratamiento (concentración de quercentina) | Índices nutricionales (%) | ||
| ICE | ECD | ANUNCIO | |
| 0 ppm | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 ppm | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
Tabla 2: Efecto de la ingesta de quercetina sobre el comportamiento alimentario y la utilización de la dieta de H. armigera . Abreviaturas: ECI = eficiencia de conversión de los alimentos ingeridos; ECD = eficiencia de conversión de los alimentos digeridos; AD = digestibilidad aproximada.
Tabla complementaria 1: Ejemplo de la hoja de datos para el ensayo de alimentación con quercetina. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Los bioensayos de laboratorio son útiles para predecir los resultados y producir datos comparativos de toxicidad de varios compuestos en un corto período de tiempo a un costo razonable. El bioensayo de alimentación ayuda a interpretar las interacciones entre insectos-insecticidas e insectos-plantas-insecticidas. Es un método eficiente para medir la toxicidad de una variedad de sustancias que simplifica significativamente el proceso de establecer la dosis letal 50 (DL50), la concentración letal 50 (LC50) o cualquier otra concentración o dosis letal24,25. Se utilizan varios bioensayos de laboratorio para determinar la actividad insecticida, la resistencia a los insecticidas y la toxicidad de los compuestos, incluida la cobertura de la dieta, la aplicación tópica, la alimentación obligada, el método de inyección, de contacto o residual, y el método de película13,14. Todos estos métodos pueden utilizarse en función del objetivo de un estudio concreto, sin embargo, el enfoque ideal de bioensayo debe ser rápido y eficaz26. Por lo tanto, el método de ensayo de alimentación obligado discutido en este manuscrito puede ser el bioensayo de elección en varios casos, excepto para insectos chupadores.
El ensayo de alimentación obligada descrito en este manuscrito se puede utilizar para estudiar el efecto de cualquier compuesto en el crecimiento, desarrollo, alimentación y supervivencia de larvas de insectos. En los resultados representativos que se muestran aquí, se examinó la actividad insecticida de la quercetina frente a las larvas de H. armigera , lo que proporciona una justificación para una mayor exploración. Se observaron reducciones significativas en el peso corporal de ~ 57% (Figura 2A, B), cambios en la tasa de alimentación (Figura 2C) y una disminución de la tasa de supervivencia de ~ 18% (Figura 4A, B) en larvas alimentadas con quercetina. Además, los insectos alimentados con una dieta de quercetina mostraron un retraso y una reducción de la pupación en ~14% (Figura 3A, B). También se observó un cambio significativo en los índices nutricionales, incluidos ECI, ECD y AD (Tabla 2), en comparación con el control. En general, estos resultados indican que la quercetina tiene un efecto deletéreo sobre el crecimiento, desarrollo y supervivencia de las larvas de H. armigera . Todas estas observaciones siguen el efecto antibiosis de la quercetina en Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 y Drosophila melanogaster29. Además, se encontró que estas observaciones concuerdan con el aumento de la letalidad en Bombyx mori debido al deterioro del sistema inmune30, la reducción del peso larvario y la fecundidad en Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 y Eriosoma lanigerum32.
Tomar precauciones, como la uniformidad en el tamaño de la muestra, es crucial para reducir la variación biológica entre los experimentos. Para garantizar la reproducibilidad, el ensayo de alimentación debe llevarse a cabo utilizando larvas de insectos del mismo estadio en una sala de cultivo de insectos a temperaturas y niveles de humedad constantes. Al preparar una dieta artificial, debe asegurarse de que el fitoquímico se mezcle uniformemente con la dieta. Para minimizar el error debido a la degradación fitoquímica a lo largo del tiempo, es preferible una dieta recién preparada para el ensayo. Las propiedades de los fitoquímicos, como la termosensibilidad, la sensibilidad a la luz, la solubilidad, etc., deben tenerse en cuenta al preparar y almacenar la dieta artificial. Las dietas que se han secado con el tiempo pueden cambiar de color y encogerse, y no deben utilizarse para el ensayo de alimentación. Los resultados del ensayo no deben considerarse cuando las tasas de mortalidad del control son superiores al 10%33. Los materiales, como espátulas, vasos de precipitados, placas de Petri, etc., necesarios para la preparación de la dieta y el pesaje de insectos deben estar separados para los grupos de control y tratamiento para evitar errores debidos a la contaminación cruzada.
El bioensayo de alimentación de insectos es altamente específico y reproducible, pero tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, cuando un insecto ataca a una planta, la inmunidad de la planta produce rasgos estructurales o químicos para reducir la alimentación de los herbívoros y, por lo tanto, minimizar el daño a los herbívoros34. Sin embargo, estos rasgos defensivos y sus efectos no se observan durante este ensayo. Otra limitación es que no se puede determinar la concentración definitiva de fitoquímicos ingeridos por los insectos14. La estabilidad del contenido nutricional de la dieta y el fitoquímico utilizado es un factor limitante importante que puede influir en su efecto sobre los insectos.
A pesar de las limitaciones mencionadas anteriormente, el ensayo de alimentación obligatoria es asequible y puede analizar una gran cantidad de insectos simultáneamente. Además, este ensayo se puede adaptar para cribar varias moléculas para estudiar sus propiedades antialimentantes e insecticidas frente a diferentes clases de insectos.
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Disclosures
Los autores declararon no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
SM, YP y VN reconocen la beca otorgada por la Comisión de Becas Universitarias del Gobierno de la India, Nueva Delhi. RJ agradece al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) de la India y al Laboratorio Químico Nacional del CSIR, Pune (India), por su apoyo financiero en virtud de los códigos de proyecto MLP036626, MLP101526 y YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
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