使用表征细胞周期同步损失模型进行跨实验比较的同步时间序列数据比对
Summary
分析同步时间序列实验的一个挑战是，实验在同步恢复时间和细胞周期周期方面通常不同。因此，来自不同实验的测量结果无法汇总分析或轻松比较。在这里，我们描述了一种对齐实验的方法，以便进行特定于阶段的比较。
Abstract
研究细胞周期通常取决于同步细胞群，以测量细胞遍历细胞周期时时间序列中的各种参数。然而，即使在类似的条件下，重复实验也显示出从同步恢复和穿越细胞周期所需的时间差异，从而阻止了每个时间点的直接比较。在突变群体或影响同步恢复时间和/或细胞周期的替代生长条件下，比较实验动态测量的问题会加剧。
我们之前发表了一个名为表征细胞周期同步损失（CLOCCS）的参数数学模型，该模型监测同步细胞群如何从同步释放并通过细胞周期进行。然后，可以使用从模型中学习到的参数将同步时间序列实验中的实验时间点转换为归一化的时间尺度（生命线点）。生命线量表不是代表从实验开始到几分钟经过的时间，而是代表从同步到细胞周期进入，然后通过细胞周期的各个阶段的进展。由于生命线点对应于同步群体中平均细胞的阶段，因此这种归一化的时间尺度允许在实验之间进行直接比较，包括具有不同周期和恢复时间的实验。此外，该模型已被用于对齐不同物种（例如， 酿酒 酵母和 庞贝裂殖酵母）之间的细胞周期实验，从而能够直接比较细胞周期测量，这可能会揭示进化的相似性和差异性。
Introduction
在细胞周期中同步进行的时间序列测量是研究控制细胞周期进程机制的标准方法1，2，3，4，5，6，7，8.跨同步/发布时间序列实验进行比较的能力对于我们理解这些动态过程至关重要。使用重复实验来证实研究结果可以增加结论可重复性的信心。此外，环境条件之间、突变体之间甚至物种之间的比较可以揭示许多关于细胞周期调控的新见解。然而，从同步恢复和细胞周期进展速度的实验间变异性损害了在重复之间或在改变细胞周期时间的实验之间进行时间点到时间点比较的能力。由于这些挑战，重复通常不包括在完整的时间序列中（例如，Spellman等人4）。当收集整个时间序列的重复时，无法汇总分析数据，而是使用单个重复进行分析，而其他重复通常降级为补充数字（例如，Orlando et al.8）。此外，具有不同回收率或细胞周期进展特征的实验之间的比较是困难的。如果跟踪这些标志物事件，则测量感兴趣的事件和细胞周期标志物之间的较小间隔（例如，芽出现，S期进入或后期发作）可以帮助减少误差1，2，3，9，10，11，12。但是，使用这些临时方法，细微但重要的差异可能仍未被发现或模糊。最后，单细胞分析允许在不依赖同步或比对的情况下分析细胞周期进程13，尽管单细胞研究中的大规模测量可能具有挑战性且成本高昂。
为了克服这些困难，我们开发了表征细胞周期同步损失（CLOCCS）模型，以帮助分析对同步群体进行的时间序列测量14，15。CLOCCS是一种灵活的数学模型，它描述了同步细胞在细胞周期阶段中的分布，因为它们在细胞周期中从同步中释放并取得进展。分支过程框架使该模型能够解释母细胞和子细胞分裂后的不对称质量 ，如酿酒酵母 所观察到的，同时仍然适用于通过裂变分裂的生物，如 S. pombe。该模型可以从一组不同的测量类型中获取输入，以指定细胞周期阶段。它可以摄取出芽细胞周期阶段数据，其中包括随时间推移的芽细胞百分比的测量，从而可以估计未出芽G1阶段14，15之外的细胞数量。该模型还可以摄取测量DNA含量的流式细胞术数据，从而能够评估从G1到S，S到G2以及M到G115的里程碑式转变。荧光形态标志物也可用于识别细胞周期阶段。肌球蛋白环、细胞核和纺锤体极体（SPB）的荧光标记可用于确定细胞周期阶段，这些被纳入CLOCCS模型11;但是，这些测量将不在本协议中描述。此外，分离指数被用作S . pombe14建模数据的输入。因此，该模型可用于各种生物体的细胞周期分析，并且可以进一步扩展。
CLOCCS是一个参数模型，允许从输入数据（例如，出芽百分比，DNA含量）对多个参数进行完整的贝叶斯推断。这些参数包括同步恢复时间，细胞周期的长度（母细胞和子细胞分别估计）以及细胞在每个时间点的平均细胞周期位置。这些参数代表了群体中平均细胞的行为，使研究人员能够将每个时间点映射到表示为生命线点的细胞周期位置。到生命线点的转换取决于 CLOCCS 参数 lambda （λ） 和 mu0 （μ0）14，15。参数λ对应于母细胞的平均细胞周期。然而，由于母女延迟14，15，这不是包括母细胞和子细胞的完整群体的平均细胞周期。CLOCCS还推断参数delta（δ），该参数对应于母子延迟，因此可以计算整个群体的平均细胞周期。最后，由于每个实验在从细胞周期同步释放后开始，因此从同步方法恢复所需的时间由 CLOCCS 参数μ 0 表示。CLOCCS 将模型拟合到输入细胞周期阶段数据，然后使用随机游走马尔可夫链蒙特卡罗算法14，15 推断这些参数。通过将多个实验映射到共同的细胞周期生命线时间尺度，可以在重复或恢复时间或细胞周期周期不相同的实验之间进行直接的阶段特异性比较8，14，15。
由于同步群体在时间序列14，15，16，17的过程中以某种速率失去同步，同步丢失率的可变性也会阻碍实验之间的定量比较。通过确定种群的位置及其分布的方差，CLOCCS解释了同步损失率的差异。这个强大的工具允许跨实验进行具体和详细的比较，从而不仅能够在重复之间，而且能够在环境条件、突变体甚至具有显着不同细胞周期计时14，15 的物种之间进行直接相关比较。
本文描述了一种使用CLOCCS的方法，通过拟合同步/发布时间序列实验的数据来估计参数，将数据映射到共同的生命线尺度，然后在重复或实验之间进行相关比较。生命线比对允许在这些实验中进行直接的阶段特异性比较，从而可以聚合和比较重复，并在具有不同恢复时间和细胞周期的实验中进行更相关的比较。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提出了一种更准确和定量地评估同步细胞群时间序列实验数据的方法。该方法利用从CLOCCS中学习的参数，CLOCCS是一种贝叶斯推理模型，它使用输入的细胞周期阶段数据（例如出芽数据和流式细胞术DNA含量数据）来参数化每个实验14，15。CLOCCS使用输入的细胞周期阶段数据来推断每个实验的参数，然后将其用于与通用生命线尺度对齐。将多个同步/发布…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione和S. Haase得到了美国国家科学基金会（DMS-1839288）和美国国立卫生研究院（5R01GM126555）的资助。此外，作者还要感谢周华瑞（杜克大学）对手稿的评论和协议的beta测试。我们还要感谢 Francis Motta（佛罗里达大西洋大学）和 Joshua Robinson 在 Java 代码方面的帮助。
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
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