Alignement de données de séries chronologiques synchronisées à l’aide du modèle de synchronisation de perte de cycle cellulaire caractérisant pour les comparaisons entre expériences
Summary
L’un des défis de l’analyse des expériences de séries chronologiques synchronisées est que les expériences diffèrent souvent par la durée de récupération de la synchronie et la période du cycle cellulaire. Ainsi, les mesures de différentes expériences ne peuvent pas être analysées globalement ou facilement comparées. Ici, nous décrivons une méthode d’alignement des expériences pour permettre des comparaisons spécifiques à la phase.
Abstract
L’étude du cycle cellulaire dépend souvent de la synchronisation des populations cellulaires pour mesurer divers paramètres dans une série chronologique lorsque les cellules traversent le cycle cellulaire. Cependant, même dans des conditions similaires, les expériences de répétition montrent des différences dans le temps nécessaire pour récupérer de la synchronie et traverser le cycle cellulaire, empêchant ainsi les comparaisons directes à chaque point temporel. Le problème de la comparaison des mesures dynamiques entre les expériences est exacerbé dans les populations mutantes ou dans d’autres conditions de croissance qui affectent le temps de récupération synchrone et / ou la période du cycle cellulaire.
Nous avons déjà publié un modèle mathématique paramétrique nommé Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) qui surveille la façon dont les populations synchrones de cellules se libèrent de la synchronie et progressent dans le cycle cellulaire. Les paramètres appris du modèle peuvent ensuite être utilisés pour convertir des points temporels expérimentaux d’expériences de séries chronologiques synchronisées en une échelle de temps normalisée (points de ligne de vie). Plutôt que de représenter le temps écoulé en minutes à partir du début de l’expérience, l’échelle de la ligne de vie représente la progression de la synchronie à l’entrée dans le cycle cellulaire, puis à travers les phases du cycle cellulaire. Étant donné que les points de survie correspondent à la phase de la cellule moyenne au sein de la population synchronisée, cette échelle de temps normalisée permet des comparaisons directes entre les expériences, y compris celles dont les périodes et les temps de récupération varient. En outre, le modèle a été utilisé pour aligner les expériences de cycle cellulaire entre différentes espèces (par exemple, Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe), permettant ainsi une comparaison directe des mesures du cycle cellulaire, ce qui peut révéler des similitudes et des différences évolutives.
Introduction
Les mesures de séries chronologiques effectuées sur des populations synchronisées de cellules au fur et à mesure qu’elles progressent dans le cycle cellulaire constituent une méthode standard pour étudier les mécanismes qui contrôlent la progression du cycle cellulaire 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacité de faire des comparaisons entre les expériences de séries chronologiques de synchronie / libération est essentielle à notre compréhension de ces processus dynamiques. L’utilisation d’expériences répétées pour corroborer les résultats peut accroître la confiance dans la reproductibilité des conclusions. En outre, les comparaisons entre les conditions environnementales, entre les mutants et même entre les espèces peuvent révéler de nombreuses nouvelles connaissances sur la régulation du cycle cellulaire. Cependant, la variabilité interexpérimentale dans la récupération de la synchronie et dans la vitesse de progression du cycle cellulaire nuit à la capacité de faire des comparaisons temporelles point à point entre les répétitions ou entre les expériences avec un calendrier du cycle cellulaire modifié. En raison de ces difficultés, les répétitions ne sont souvent pas incluses pour la série chronologique complète (p. ex., Spellman et coll.4). Lorsque des répétitions pour l’ensemble de la série chronologique sont recueillies, les données ne peuvent pas être analysées globalement, mais une seule répétition est utilisée pour l’analyse, et d’autres répétitions sont souvent reléguées à des chiffres supplémentaires (p. ex., Orlando et coll.8). En outre, les comparaisons entre les expériences présentant différentes caractéristiques de récupération ou de progression du cycle cellulaire sont difficiles. Les mesures d’intervalles plus petits entre un événement d’intérêt et un point de repère du cycle cellulaire (p. ex., émergence des bourgeons, entrée en phase S ou début de l’anaphase) peuvent aider à réduire les erreurs si ces événements marquants sont suivis 1,2,3,9,10,11,12. Cependant, des différences subtiles mais importantes peuvent rester non détectées ou masquées à l’aide de ces méthodes ad hoc. Enfin, les analyses unicellulaires permettent d’analyser la progression du cycle cellulaire sans recourir à la synchronisation ou à l’alignement13, bien que les mesures à grande échelle dans les études unicellulaires puissent être difficiles et coûteuses.
Pour surmonter ces difficultés, nous avons développé le modèle CLOCCS (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) pour faciliter l’analyse des mesures de séries chronologiques effectuées sur des populations synchronisées14,15. CLOCCS est un modèle mathématique flexible qui décrit la distribution des cellules synchronisées à travers les phases du cycle cellulaire lorsqu’elles sont libérées de la synchronie et progressent dans le cycle cellulaire. Le cadre du processus de ramification permet au modèle de tenir compte des qualités asymétriques des cellules mères et filles après division, comme observé chez S. cerevisiae, tout en étant utile pour les organismes qui se divisent par fission, comme S. pombe. Le modèle peut prendre des entrées d’un ensemble diversifié de types de mesure pour spécifier la phase du cycle cellulaire. Il peut ingérer des données de phase du cycle cellulaire bourgeonnant, qui comprennent des mesures du pourcentage de cellules bourgeonnées au fil du temps, ce qui permet d’estimer le nombre de cellules en dehors de la phase G1 non bourgeonnée14,15. Le modèle peut également ingérer des données cytométriques en flux qui mesurent la teneur en ADN, permettant ainsi d’évaluer les transitions marquantes de G1 à S, S à G2 et de M à G115. Des marqueurs morphologiques fluorescents peuvent également être utilisés pour identifier la phase du cycle cellulaire. Le marquage fluorescent des anneaux de myosine, des noyaux et des corps de fuseau (SPB) peut être utilisé pour déterminer la phase du cycle cellulaire, et ceux-ci ont été incorporés dans le modèle CLOCCS11; Toutefois, ces mesures ne seront pas décrites dans le présent protocole. De plus, l’indice de septation a été utilisé comme entrée pour les données de modélisation de S. pombe14. Ainsi, le modèle peut être utilisé pour les analyses du cycle cellulaire dans une variété d’organismes et peut être étendu davantage.
CLOCCS est un modèle paramétrique qui permet l’inférence bayésienne complète de plusieurs paramètres à partir des données d’entrée (par exemple, pourcentage bourgeonnant, contenu en ADN). Ces paramètres comprennent le temps de récupération de la synchronie, la durée de la période du cycle cellulaire (estimée séparément pour les cellules mères et filles) et la position moyenne du cycle cellulaire des cellules à chaque point temporel. Ces paramètres représentent le comportement de la cellule moyenne dans la population, permettant au chercheur de mapper chaque point temporel à une position du cycle cellulaire exprimée comme un point de ligne de vie. La conversion en points de ligne de vie dépend des paramètres CLOCCS lambda (λ) et mu0 (μ0)14,15. Le paramètre λ correspond à la période moyenne du cycle cellulaire des cellules mères. Cependant, en raison du retardmère-fille 14,15, il ne s’agit pas de la période moyenne du cycle cellulaire de l’ensemble de la population qui comprend à la fois les cellules mère et fille. CLOCCS déduit en outre le paramètre delta (δ), qui correspond au délai mère-fille et, ainsi, permet le calcul de la période moyenne du cycle cellulaire de l’ensemble de la population. Enfin, étant donné que chaque expérience commence après la libération de la synchronisation du cycle cellulaire, le temps nécessaire pour récupérer à partir de la méthode de synchronisation est représenté par le paramètre CLOCCS μ0. CLOCCS ajuste un modèle aux données de phase du cycle cellulaire d’entrée, puis déduit ces paramètres à l’aide d’un algorithme de Monte-Carlo à chaîne de Markov14,15. En mappant plusieurs expériences à une échelle de temps de cycle cellulaire commune, des comparaisons directes spécifiques à la phase peuvent être effectuées entre des répétitions ou des expériences où le temps de récupération ou les périodes de cycle cellulaire ne sont pas identiques 8,14,15.
Comme les populations synchronisées perdent leur synchronie à un certain rythme au cours des séries chronologiques14,15,16,17, la variabilité du taux de perte de synchronie peut également entraver les comparaisons quantitatives entre les expériences. En identifiant l’emplacement des populations et la variance de leurs répartitions, CLOCCS tient compte des différences dans les taux de perte de synchronie. Cet outil puissant permet des comparaisons spécifiques et détaillées entre les expériences, offrant ainsi la possibilité de faire directement des comparaisons pertinentes non seulement entre les répétitions, mais aussi entre les conditions environnementales, les mutants et même les espèces qui ont un calendrier de cycle cellulaire radicalement différent14,15.
Cet article décrit une méthode utilisant CLOCCS pour estimer les paramètres en ajustant les données des expériences de séries chronologiques de synchronie/libération, mapper les données à une échelle de ligne de vie commune, puis effectuer des comparaisons pertinentes entre les répétitions ou les expériences. L’alignement de la ligne de vie permet des comparaisons directes spécifiques à la phase entre ces expériences, ce qui permet l’agrégation et la comparaison des répétitions et de faire des comparaisons plus pertinentes entre les expériences avec différents moments de récupération et périodes de cycle cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente une méthode permettant d’évaluer plus précisément et quantitativement les données provenant d’expériences de séries chronologiques sur des populations synchronisées de cellules. La méthode utilise les paramètres appris de CLOCCS, un modèle d’inférence bayésien qui utilise des données de phase du cycle cellulaire d’entrée, telles que les données bourgeonnantes et les données de contenu d’ADN cytométrique en flux, pour paramétrer chaque expérience14,15</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione et S. Haase ont bénéficié d’un financement de la National Science Foundation (DMS-1839288) et des National Institutes of Health (5R01GM126555). De plus, les auteurs aimeraient remercier Huarui Zhou (Duke University) pour ses commentaires sur le manuscrit et pour les tests bêta du protocole. Nous remercions également Francis Motta (Florida Atlantic University) et Joshua Robinson pour leur aide avec le code Java.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
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