יישור נתוני סדרות זמן מסונכרנות באמצעות מודל אפיון אובדן מחזור התא לצורך השוואות בין ניסויים
Summary
אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.
Abstract
חקירת מחזור התא תלויה לעתים קרובות בסנכרון אוכלוסיות תאים כדי למדוד פרמטרים שונים בסדרת זמן כאשר התאים חוצים את מחזור התא. עם זאת, גם בתנאים דומים, ניסויים משוכפלים מציגים הבדלים בזמן הדרוש כדי להתאושש מסנכרון ולחצות את מחזור התא, ובכך למנוע השוואות ישירות בכל נקודת זמן. הבעיה של השוואת מדידות דינמיות בין ניסויים מחריפה באוכלוסיות מוטנטיות או בתנאי גידול חלופיים המשפיעים על זמן ההתאוששות המסונכרן ו/או על תקופת מחזור התא.
פרסמנו בעבר מודל מתמטי פרמטרי בשם Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) המנטר כיצד אוכלוסיות סינכרוניות של תאים משתחררות מסנכרון ומתקדמות במחזור התא. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרמטרים הנלמדים מהמודל כדי להמיר נקודות זמן ניסיוניות מניסויים מסונכרנים בסדרות זמן לסולם זמן מנורמל (נקודות קו חיים). במקום לייצג את הזמן שחלף בדקות מתחילת הניסוי, סולם קו החיים מייצג את ההתקדמות מסנכרון לכניסה למחזור התא ולאחר מכן דרך השלבים של מחזור התא. מכיוון שנקודות עורק החיים תואמות את הפאזה של התא הממוצע באוכלוסייה המסונכרנת, סולם זמן מנורמל זה מאפשר השוואה ישירה בין ניסויים, כולל אלה עם תקופות שונות וזמני התאוששות. יתר על כן, המודל שימש ליישור ניסויים במחזור התא בין מינים שונים (למשל, Saccharomyces cerevisiae ו – Schizosaccharomyces pombe), ובכך מאפשר השוואה ישירה של מדידות מחזור התא, אשר עשוי לחשוף דמיון והבדלים אבולוציוניים.
Introduction
מדידות סדרות זמן המבוצעות על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים בזמן שהן מתקדמות במחזור התא היא שיטה סטנדרטית לחקר המנגנונים השולטים בהתקדמות מחזור התא 1,2,3,4,5,6,7,8 . היכולת לערוך השוואות בין ניסויים בסדרות זמן סינכרוני/שחרור חיונית להבנתנו את התהליכים הדינמיים הללו. השימוש בניסויים משוכפלים כדי לאשש ממצאים יכול להגביר את הביטחון ביכולת השחזור של המסקנות. יתר על כן, השוואות בין תנאי הסביבה, בין מוטנטים ואפילו בין מינים יכולים לחשוף תובנות חדשות רבות על ויסות מחזור התא. עם זאת, שונות בין-ניסויית בהתאוששות מסנכרון ובמהירות התקדמות מחזור התא פוגעת ביכולת לבצע השוואות בין נקודת זמן לנקודת זמן בין עותקים משוכפלים או בין ניסויים עם תזמון שונה של מחזור התא. בשל אתגרים אלה, עותקים משוכפלים לעתים קרובות אינם נכללים עבור הסדרה במשרה מלאה (למשל, Spellman et al.4). כאשר אוספים עותקים משוכפלים לכל סדרות הזמן, לא ניתן לנתח את הנתונים במצטבר, אלא משתמשים בשכפול יחיד לניתוח, ומשכפלים אחרים נדחקים לעתים קרובות לנתונים משלימים (למשל, אורלנדו ואחרים). יתר על כן, קשה להשוות בין ניסויים בעלי מאפייני התאוששות או התקדמות שונים של מחזור התא. המדידות של מרווחי זמן קטנים יותר בין אירוע מעניין לבין ציון דרך במחזור התא (לדוגמה, הופעת ניצן, כניסה לשלב S או תחילת אנאפאזה) יכולות לסייע בהפחתת שגיאות אם עוקבים אחר אירועים ציון דרך אלה 1,2,3,9,10,11,12. עם זאת, הבדלים עדינים אך חשובים עשויים להישאר בלתי מזוהים או מוסתרים באמצעות שיטות אד הוק אלה. לבסוף, ניתוחים של תא בודד מאפשרים לנתח את התקדמות מחזור התא מבלי להסתמך על סנכרון או יישור13, אם כי מדידות בקנה מידה גדול במחקרים על תא בודד יכולות להיות מאתגרות ויקרות.
כדי להתגבר על קשיים אלה, פיתחנו את מודל Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) כדי לסייע בניתוח מדידות סדרות זמן שבוצעו על אוכלוסיות מסונכרנות14,15. CLOCCS הוא מודל מתמטי גמיש המתאר את התפלגות התאים המסונכרנים על פני שלבי מחזור התא כשהם משתחררים מסנכרון ומתקדמים במחזור התא. מסגרת תהליך ההסתעפות מאפשרת למודל להסביר את התכונות הא-סימטריות של תאי האם והבת לאחר החלוקה, כפי שנצפה ב-S. cerevisiae, ועדיין להיות שימושית עבור אורגניזמים המתחלקים בביקוע, כגון S. pombe. המודל יכול לקחת קלט ממגוון סוגי מדידה כדי לציין את שלב מחזור התא. הוא יכול לבלוע נתוני פאזות של מחזור התא הניצני, הכוללים מדידות של אחוז התאים הניצנים לאורך זמן, מה שמאפשר להעריך את מספר התאים מחוץ לשלב G114,15 שלא ניצן. המודל יכול גם לבלוע נתונים ציטומטריים זורמים המודדים את תכולת הדנ”א, ובכך לאפשר הערכה של מעברים פורצי דרך מ-G1 ל-S, S ל-G2 ו-M ל-G115. ניתן להשתמש בסמנים מורפולוגיים פלואורסצנטיים גם כדי לזהות את שלב מחזור התא. ניתן להשתמש בתיוג הפלואורסצנטי של טבעות מיוזין, גרעינים וגופי מוטות ציר (SPBs) כדי לקבוע את שלב מחזור התא, ואלה שולבו במודל CLOCCS11; עם זאת, מדידות אלה לא יתוארו בפרוטוקול זה. בנוסף, מדד הספטציה שימש כקלט למידול נתונים מ- S. pombe14. לפיכך, המודל יכול לשמש לניתוח מחזור התא במגוון אורגניזמים וניתן להרחיב אותו עוד יותר.
CLOCCS הוא מודל פרמטרי המאפשר הסקה בייסיאנית מלאה של פרמטרים מרובים מנתוני הקלט (למשל, אחוז ניצנים, תוכן DNA). פרמטרים אלה כוללים את זמן ההתאוששות מסנכרון, אורך תקופת מחזור התא (המוערך בנפרד עבור תאי אם ובת), ואת המיקום הממוצע של מחזור התא של התאים בכל נקודת זמן. פרמטרים אלה מייצגים את התנהגות התא הממוצע באוכלוסייה, ומאפשרים לחוקר למפות בכל נקודת זמן למיקום מחזור התא המתבטא כנקודת עורק חיים. ההמרה לנקודות קו חיים תלויה בפרמטרי CLOCCS lambda (λ) ו- mu0 (μ0)14,15. הפרמטר λ מתאים לתקופת מחזור התא הממוצעת של תאי האם. עם זאת, בשל עיכובאם-בת 14,15, זו אינה תקופת מחזור התא הממוצעת של כלל האוכלוסייה הכוללת הן את תאי האם והן את תאי הבת. CLOCCS גם מסיק את הפרמטר דלתא (δ), המתאים לעיכוב אם-בת, ובכך מאפשר חישוב של תקופת מחזור התא הממוצעת של האוכלוסייה כולה. לבסוף, מכיוון שכל ניסוי מתחיל לאחר שחרור מסנכרון מחזור התא, הזמן הדרוש להתאוששות משיטת הסינכרון מיוצג על ידי הפרמטר CLOCCS μ0. CLOCCS מתאים מודל לנתוני הפאזה של מחזור תא הקלט ולאחר מכן מסיק פרמטרים אלה באמצעות הליכה אקראית שרשרת מרקוב אלגוריתם מונטה קרלו14,15. על ידי מיפוי ניסויים מרובים לסולם זמן משותף של מחזור התא, ניתן לבצע השוואות ישירות ספציפיות לפאזה בין משכפלים או ניסויים שבהם זמן ההתאוששות או תקופות מחזור התא אינם זהים 8,14,15.
מכיוון שאוכלוסיות מסונכרנות מאבדות סנכרון בקצב מסוים במהלך סדרות הזמן14,15,16,17, שונות בקצב אובדן הסנכרון יכולה גם לעכב השוואות כמותיות בין ניסויים. על ידי זיהוי מיקום האוכלוסיות והשונות בהתפלגות שלהן, CLOCCS מסביר הבדלים בשיעורי אובדן הסנכרון. כלי רב עוצמה זה מאפשר השוואות ספציפיות ומפורטות בין ניסויים, ובכך מספק את היכולת לבצע השוואות רלוונטיות ישירות לא רק בין שכפולים אלא גם בין תנאי סביבה, מוטנטים, ואפילו מינים שיש להם תזמון מחזור תא שונה באופן דרמטי14,15.
מאמר זה מתאר שיטה המשתמשת ב- CLOCCS כדי להעריך פרמטרים על-ידי התאמת נתונים מניסויים מסנכרון/שחרור סדרות זמן, מיפוי הנתונים לקנה מידה משותף של קו חיים ולאחר מכן ביצוע השוואות רלוונטיות בין עותקים משוכפלים או ניסויים. יישור קו החיים מאפשר השוואות ישירות ספציפיות לפאזה על פני ניסויים אלה, מה שמאפשר צבירה והשוואה של עותקים משוכפלים וביצוע השוואות רלוונטיות יותר בין ניסויים עם תזמוני התאוששות שונים ותקופות מחזור תאים שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג שיטה להערכה מדויקת וכמותית יותר של נתונים מניסויים בסדרות זמן על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים. השיטה משתמשת בפרמטרים שנלמדו מ-CLOCCS, מודל היסק בייסיאני המשתמש בנתוני פאזות של מחזור תאי קלט, כגון נתוני ניצנים ונתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה, כדי לקבוע פרמטרים לכל ניסוי14…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קמפיונה וס’ האזה נתמכו על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (DMS-1839288) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (5R01GM126555). בנוסף, המחברים רוצים להודות ל-Huarui Zhou (אוניברסיטת דיוק) על הערות על כתב היד ועל בדיקת בטא של הפרוטוקול. אנו מודים גם לפרנסיס מוטה (אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק) וג’ושוע רובינסון על עזרתם בקוד Java.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
References
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
