सिंक्रनाइज़ किए गए समय-श्रृंखला प्रयोगों का विश्लेषण करने की एक चुनौती यह है कि प्रयोग अक्सर सिंक्रनाइज़ और सेल-चक्र अवधि से वसूली की लंबाई में भिन्न होते हैं। इस प्रकार, विभिन्न प्रयोगों से माप का समग्र रूप से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है या आसानी से तुलना नहीं की जा सकती है। यहां, हम चरण-विशिष्ट तुलनाओं की अनुमति देने के लिए प्रयोगों को संरेखित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
सेल चक्र की जांच अक्सर एक समय श्रृंखला में विभिन्न मापदंडों को मापने के लिए सेल आबादी को सिंक्रनाइज़ करने पर निर्भर करती है क्योंकि कोशिकाएं सेल चक्र को पार करती हैं। हालांकि, समान परिस्थितियों में भी, प्रतिकृति प्रयोग सिंक्रनाइज़ से उबरने और सेल चक्र को पार करने के लिए आवश्यक समय में अंतर प्रदर्शित करते हैं, इस प्रकार प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्यक्ष तुलना को रोकते हैं। प्रयोगों में गतिशील माप ों की तुलना करने की समस्या उत्परिवर्ती आबादी या वैकल्पिक विकास स्थितियों में बढ़ जाती है जो सिंक्रनाइज़ रिकवरी समय और / या सेल-चक्र अवधि को प्रभावित करती हैं।
हमने पहले एक पैरामीट्रिक गणितीय मॉडल प्रकाशित किया है जिसका नाम सेल चक्र सिंक्रनाइज़ (सीएलओसीसीएस) के नुकसान को चिह्नित करना है जो निगरानी करता है कि कोशिकाओं की तुल्यकालिक आबादी सिंक्रनाइज़ से कैसे निकलती है और सेल चक्र के माध्यम से प्रगति करती है। मॉडल से सीखे गए मापदंडों का उपयोग तब सिंक्रनाइज़ किए गए समय-श्रृंखला प्रयोगों से प्रयोगात्मक समय बिंदुओं को सामान्यीकृत समय पैमाने (लाइफलाइन पॉइंट) में परिवर्तित करने के लिए किया जा सकता है। प्रयोग की शुरुआत से मिनटों में बीते समय का प्रतिनिधित्व करने के बजाय, लाइफलाइन स्केल सिंक्रनाइज़ से सेल-चक्र प्रवेश और फिर सेल चक्र के चरणों के माध्यम से प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। चूंकि लाइफलाइन बिंदु सिंक्रनाइज़ आबादी के भीतर औसत सेल के चरण के अनुरूप हैं, इसलिए यह सामान्यीकृत समय पैमाना प्रयोगों के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है, जिसमें अलग-अलग अवधि और पुनर्प्राप्ति समय शामिल हैं। इसके अलावा, मॉडल का उपयोग विभिन्न प्रजातियों (जैसे, सैकरोमाइसेस सेरेविसिया और स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे) के बीच सेल-चक्र प्रयोगों को संरेखित करने के लिए किया गया है, इस प्रकार सेल-चक्र माप की सीधी तुलना को सक्षम करता है, जो विकासवादी समानता और अंतर को प्रकट कर सकता है।
कोशिकाओं की सिंक्रनाइज़ आबादी पर किए गए समय-श्रृंखला माप क्योंकि वे सेल चक्र के माध्यम से प्रगति करते हैं, उन तंत्रों की जांच के लिए एक मानक विधि है जो सेल-चक्र प्रगति 1,2,3,4,5,6,7,8 को नियंत्रित करते हैं।. सिंक्रनाइज़ / रिलीज़ टाइम-सीरीज़ प्रयोगों में तुलना करने की क्षमता इन गतिशील प्रक्रियाओं की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है। निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए प्रतिकृति प्रयोगों का उपयोग निष्कर्षों की प्रजनन क्षमता में विश्वास बढ़ा सकता है। इसके अलावा, पर्यावरणीय परिस्थितियों के बीच, उत्परिवर्ती में, और यहां तक कि प्रजातियों के बीच तुलना सेल-चक्र विनियमन में कई नई अंतर्दृष्टि को उजागर कर सकती है। हालांकि, सिंक्रनाइज़ से वसूली में और सेल-चक्र प्रगति की गति में अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता प्रतिकृति में या परिवर्तित सेल-चक्र समय के साथ प्रयोगों के बीच समय-बिंदु-से-समय-बिंदु तुलना करने की क्षमता को बाधित करती है। इन चुनौतियों के कारण, प्रतिकृति को अक्सर पूर्णकालिक श्रृंखला (जैसे, स्पेलमैन एट अल.4) के लिए शामिल नहीं किया जाता है। जब पूरे समय श्रृंखला के लिए प्रतिकृतियां एकत्र की जाती हैं, तो डेटा का समग्र रूप से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, बल्कि विश्लेषण के लिए एक एकल प्रतिकृति का उपयोग किया जाता है, और अन्य प्रतिकृतियों को अक्सर पूरक आंकड़ों (जैसे, ऑरलैंडो एट अल.8) में डाल दिया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न वसूली या सेल-चक्र प्रगति विशेषताओं के साथ प्रयोगों के बीच तुलना मुश्किल है। रुचि की घटना और सेल-चक्र लैंडमार्क (जैसे, कली उद्भव, एस-चरण प्रविष्टि, या एनाफ़ेज़ शुरुआत) के बीच छोटे अंतराल के माप त्रुटियों को कम करने में मदद कर सकते हैं यदि इन ऐतिहासिक घटनाओं को 1,2,3,9,10,11,12 ट्रैक किया जाता है। हालांकि, इन तदर्थ तरीकों का उपयोग करके सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण अंतर अज्ञात या अस्पष्ट रह सकते हैं। अंत में, एकल-सेल विश्लेषण सिंक्रनाइज़ेशन या संरेखण13 पर भरोसा किए बिना सेल-चक्र प्रगति का विश्लेषण करने की अनुमति देता है, हालांकि एकल-सेल अध्ययन में बड़े पैमाने पर माप चुनौतीपूर्ण और महंगा हो सकता है।
इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, हमने सिंक्रनाइज़ आबादी14,15 पर किए गए समय-श्रृंखला माप के विश्लेषण में सहायता के लिए सेल चक्र सिंक्रनाइज़ (सीएलओसीसीएस) मॉडल की विशेषता हानि विकसित की। सीएलओसीसीएस एक लचीला गणितीय मॉडल है जो सेल-चक्र चरणों में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के वितरण का वर्णन करता है क्योंकि वे सेल चक्र के माध्यम से सिंक्रनाइज़ और प्रगति से जारी होते हैं। ब्रांचिंग प्रोसेस फ्रेमवर्क मॉडल को विभाजन के बाद मां और बेटी की कोशिकाओं के असममित गुणों का हिसाब लगाने में सक्षम बनाता है, जैसा कि एस सेरेविसिया में देखा गया है, जबकि अभी भी उन जीवों के लिए उपयोगी है जो विखंडन से विभाजित होते हैं, जैसे कि एस पोम्बे। मॉडल सेल-चक्र चरण को निर्दिष्ट करने के लिए माप प्रकारों के एक विविध सेट से इनपुट ले सकता है। यह नवोदित सेल-चक्र चरण डेटा को निगल सकता है, जिसमें समय के साथ प्रतिशत बुड्ड कोशिकाओं के माप शामिल हैं, जिससे अनबुडेड जी 1 चरण14,15 के बाहर कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है। मॉडल फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा को भी निगल सकता है जो डीएनए सामग्री को मापता है, इस प्रकार जी 1 से एस, एस से जी 2 और एम से जी 115 तक लैंडमार्क संक्रमण के आकलन को सक्षम करता है। फ्लोरोसेंट मॉर्फोलॉजिकल मार्करों का उपयोग सेल-चक्र चरण की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। मायोसिन रिंग, नाभिक और स्पिंडल पोल बॉडी (एसपीबी) के फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग सेल-चक्र चरण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और इन्हें सीएलओसीसीएस मॉडल11 में शामिल किया गया था; हालाँकि, इन मापों को इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, सेप्टेशन इंडेक्स का उपयोग एस पोम्बे14 से मॉडलिंग डेटा के लिए इनपुट के रूप में किया गया था। इस प्रकार, मॉडल का उपयोग विभिन्न प्रकार के जीवों में सेल-चक्र विश्लेषण के लिए किया जा सकता है और इसे आगे बढ़ाया जा सकता है।
सीएलओसीसीएस एक पैरामीट्रिक मॉडल है जो इनपुट डेटा (जैसे, नवोदित प्रतिशत, डीएनए सामग्री) से कई मापदंडों के पूर्ण बायेसियन अनुमान की अनुमति देता है। इन मापदंडों में सिंक्रनाइज़ से पुनर्प्राप्ति समय, सेल-चक्र अवधि की लंबाई (मां और बेटी कोशिकाओं के लिए अलग-अलग अनुमानित), और प्रत्येक समय बिंदु पर कोशिकाओं की औसत सेल-चक्र स्थिति शामिल है। ये पैरामीटर आबादी में औसत सेल के व्यवहार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिससे शोधकर्ता को प्रत्येक समय बिंदु को जीवन रेखा बिंदु के रूप में व्यक्त सेल-चक्र की स्थिति में मैप करने में सक्षम बनाता है। लाइफलाइन बिंदुओं में रूपांतरण सीएलओसीसीएस पैरामीटर लैम्ब्डा (3) और एमयू0 (μ0) 14,15 पर निर्भर करता है। पैरामीटर : मां कोशिकाओं की औसत सेल-चक्र अवधि से मेल खाता है। हालांकि, मां-बेटी की देरी14,15 के कारण, यह पूर्ण आबादी की औसत सेल-चक्र अवधि नहीं है जिसमें मां और बेटी दोनों कोशिकाएं शामिल हैं। सीएलओसीसीएस पैरामीटर डेल्टा (δ) का भी अनुमान लगाता है, जो मां-बेटी की देरी से मेल खाता है और इस प्रकार, पूर्ण आबादी की औसत सेल-चक्र अवधि की गणना करने की अनुमति देता है। अंत में, क्योंकि प्रत्येक प्रयोग सेल-चक्र सिंक्रनाइज़ेशन से रिलीज़ के बाद शुरू होता है, सिंक्रनाइज़ेशन विधि से पुनर्प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को सीएलओसीसीएस पैरामीटर μ0 द्वारा दर्शाया जाता है। सीएलओसीसीएस इनपुट सेल-चक्र चरण डेटा के लिए एक मॉडल फिट बैठता है और फिर यादृच्छिक वॉक मार्कोव श्रृंखला मोंटे कार्लो एल्गोरिदम14,15 का उपयोग करके इन मापदंडों का अनुमान लगाता है। एक सामान्य सेल-चक्र लाइफलाइन टाइम स्केल पर कई प्रयोगों को मैप करके, प्रतिकृति या प्रयोगों के बीच प्रत्यक्ष चरण-विशिष्ट तुलना की जा सकती है जहां पुनर्प्राप्ति समय या सेल-चक्र अवधिसमान 8,14,15 नहीं है।
चूंकि सिंक्रनाइज़ की गई आबादी समय श्रृंखला14,15,16,17 के दौरान कुछ दर पर सिंक्रनाइज़ खो देती है, सिंक्रनाइज़ हानि की दर में परिवर्तनशीलता भी प्रयोगों में मात्रात्मक तुलना में बाधा डाल सकती है। आबादी के स्थान और उनके वितरण में भिन्नता की पहचान करके, सीएलओसीसीएस सिंक्रनाइज़ हानि की दरों में अंतर के लिए जिम्मेदार है। यह शक्तिशाली उपकरण प्रयोगों में विशिष्ट और विस्तृत तुलना के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार न केवल प्रतिकृति के बीच बल्कि पर्यावरणीय परिस्थितियों, उत्परिवर्ती और यहां तक कि प्रजातियों के बीच भी प्रासंगिक तुलना करने की क्षमता प्रदान करता है जिनके पास नाटकीय रूप से अलग सेल-चक्र समय14,15 है।
रिलीज समय-श्रृंखला प्रयोगों से डेटा फिट करके मापदंडों का अनुमान लगाने के लिए सीएलओसीसीएस का उपयोग करने वाली एक विधि का वर्णन करता है, डेटा को एक सामान्य जीवन रेखा पैमाने पर मैप करता है, और फिर प्रतिकृति या प्रयोगों के बीच प्रासंगिक तुलना करता है। लाइफलाइन संरेखण इन प्रयोगों में प्रत्यक्ष चरण-विशिष्ट तुलना की अनुमति देता है, जो प्रतिकृति के एकत्रीकरण और तुलना के लिए और विभिन्न पुनर्प्राप्ति समय और सेल-चक्र अवधि के साथ प्रयोगों में अधिक प्रासंगिक तुलना करने की अनुमति देता है।
यह पेपर कोशिकाओं की सिंक्रनाइज़ आबादी पर समय-श्रृंखला प्रयोगों से डेटा का अधिक सटीक और मात्रात्मक आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। विधि सीएलओसीसीएस से सीखे गए मापदंडों का उपयोग करती है, एक ब?…
The authors have nothing to disclose.
एस कैम्पियोन और एस हासे को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (डीएमएस -1839288) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (5आर01जीएम126555) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त, लेखक पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए और प्रोटोकॉल के बीटा परीक्षण के लिए हुआरुई झोउ (ड्यूक विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम जावा कोड के साथ उनकी मदद के लिए फ्रांसिस मोट्टा (फ्लोरिडा अटलांटिक विश्वविद्यालय) और जोशुआ रॉबिन्सन को भी धन्यवाद देते हैं।
2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
Git | https://git-scm.com/ | ||
Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
Microscope | For counting cells and buds. | ||
Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
Tris | pH 7.5 |