인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광
Summary
이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.
Abstract
이중 가닥 절단(DSB)은 세포핵에서 발생할 수 있는 가장 심각한 병변 중 하나이며, 복구하지 않으면 암을 포함한 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 세포에는 DSB를 복구하는 복잡한 메커니즘이 제공되며 이러한 경로는 Ser-139(즉, γH2AX) 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)에서 인산화된 형태의 히스톤 H2AX를 포함합니다. 두 단백질 모두 DSB 부위에서 병소를 형성할 수 있기 때문에 이러한 마커의 식별은 DSB와 복구 동역학을 모두 연구하는 데 적합한 방법으로 간주됩니다. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성으로 이어지는 분자 과정에 따르면, 두 개의 DNA 손상 마커를 동시에 검출하여 DSB를 정량화할 수 있는 대체 접근법을 설정하기 위해 DSB 근처의 공동 국소화를 조사하는 것이 더 유용할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 이중 면역형광에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 존재를 통해 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 또한 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 연구하기 위한 예비 시도로 시간 경과에 따른 γH2AX 및 53BP1 병소 수의 변화를 설명했습니다.
Introduction
DNA 손상은 세포 산화 대사에 의해 생성된 ROS와 같은 내인성일 수 있는 작용제에 의해 연속적으로 유도되거나, 또는 외인성, 화학적 및 물리적둘 다1. 가장 해로운 병변 중 이중 가닥 절단(DSB)은 염색체 이상을 일으켜 발암 과정을 시작할 수 있기 때문에 게놈 불안정성에 기여하는 근본적인 역할을 합니다. 따라서, 세포는 DSBs를 복구하는 복잡하고 효율적인 메카니즘을 제공받는다2.
DSB가 발생하면 세포는 MRE11/RAD50/NBS1 복합체와 함께 ATM 또는 ATR 키나아제를 모집하여 세포 주기를 늦추거나 멈추게 하는 다른 단백질을 활성화하는 DNA 손상 반응(DDR)을 유발합니다3. 이러한 키나아제의 필수 표적은 히스톤 H2AX이며, 이는 DSB(즉, γH2AX)로부터 몇 메가베이스 내에서 Ser-139에 인산화되어 BRCA1 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)3. 나중에, 상동 재조합 (HR), 비-상동 말단 접합 (NHEJ), 또는 단일-가닥 어닐링 (SSA) 중 하나의 경로가 DSB를 복구하기 위해 트리거된다 4,5. 따라서 53BP1은 HR 또는 NHEJ 중 하나를 선택하는 데 관여하며 주로 HR6보다는 NHEJ의 활성화를 촉진합니다. 또한, H2AX 히스톤과 53BP1의 인산화 된 형태는 모두 DSB 부위에서 병소를 형성 할 수 있습니다. 이들 병소는 이중 가닥의 완전성이 회복될 때까지 지속되므로, 시간 간격 내에 γH2AX 또는 53BP1 병소의 출현/소실을 평가하는 것은 셀 시스템에서 DSB의 발생 및 복구를 평가하는 유용한 방법으로 간주된다 6,7. 그러나, 상기 기술된 분자 과정에 따르면, γH2AX 및 53BP1 초점은 DDR8,9 동안 DSB 근처에서 공동 국소화될 것으로 예상되기 때문에, 이중 면역형광에서 이들 마커의 존재를 동시에 검출하는 것이 유용할 수 있다.
따라서, 이 원고의 목적은 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 말초 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하기 위해 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 정량화의 적합성을 평가하는 것이었습니다. 동일한 방법론을 사용하여 이전에 설정된 실험 절차10에 따라 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 설명하려고 시도했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
γH2AX 및 53BP1 병소의 면역형광 분석은 세포 시스템의 간기 핵에서 게놈 손상을 평가하는 데 적합한 방법입니다. 이 절차에는 실험 결과, 주로 고정 및 투과에 사용되는 제제, 항체 유형 및 희석 인자, 돌연변이 유발 물질의 농도에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다.
면역형광법은 주로 단백질인 항원을 식별할 것으로 예상하기 때문에 단백질 무결성의 유지?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
혈액 샘플을 채취 한 전혈 기증자와 모든 의료진에게 감사드립니다.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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