Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains
Summary
Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.
Abstract
Les cassures double brin (DSB) sont l’une des lésions les plus graves qui peuvent survenir dans les noyaux cellulaires et, si elles ne sont pas réparées, elles peuvent entraîner des conséquences graves, y compris le cancer. La cellule est donc dotée de mécanismes complexes pour réparer les DSB, et ces voies impliquent l’histone H2AX sous sa forme phosphorylée à Ser-139 (à savoir γH2AX) et la protéine de liaison p53 1 (53BP1). Comme les deux protéines peuvent former des foyers sur les sites des DSB, l’identification de ces marqueurs est considérée comme une méthode appropriée pour étudier à la fois les DSB et leur cinétique de réparation. Selon les processus moléculaires qui conduisent à la formation des foyers γH2AX et 53BP1, il pourrait être plus utile d’étudier leur co-localisation à proximité des DSB afin de mettre en place une approche alternative permettant de quantifier les DSB par la détection simultanée de deux marqueurs de dommages à l’ADN. Ainsi, ce protocole vise à évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes humains par l’agent radiomimétique bléomycine par la présence de foyers γH2AX et 53BP1 dans une double immunofluorescence. En utilisant cette méthodologie, nous avons également délimité la variation du nombre de foyers γH2AX et 53BP1 au fil du temps, comme tentative préliminaire d’étudier la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine.
Introduction
Les dommages à l’ADN sont continuellement induits par des agents qui peuvent être endogènes, tels que les ROS générés par le métabolisme oxydatif cellulaire, ou exogènes, à la fois chimiques et physiques1. Parmi les lésions les plus nocives, les cassures double brin (DSB) jouent un rôle fondamental en contribuant à l’instabilité génomique, car elles provoquent des aberrations chromosomiques qui peuvent à leur tour initier le processus de cancérogenèse. Ainsi, les cellules sont pourvues de mécanismes complexes et efficaces de réparationDSBs 2.
Lorsqu’un DSB se produit, la cellule déclenche la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) où, avec le complexe MRE11 / RAD50 / NBS1, les kinases ATM ou ATR sont recrutées pour activer d’autres protéines qui ralentissent ou arrêtent le cycle cellulaire3. Une cible essentielle de ces kinases est l’histone H2AX, qui est phosphorylée sur Ser-139 au sein de quelques mégabases issues des DSB (à savoir γH2AX), permettant ainsi le recrutement de plusieurs facteurs de réparation tels que, entre autres, BRCA1 et p53 binding protein 1 (53BP1)3. Plus tard, une voie entre la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) ou le recuit simple brin (SSA) est déclenchée pour réparer les DSB 4,5. Par conséquent, 53BP1 est impliqué dans la dictée du choix entre HR ou NHEJ, favorisant principalement l’activation de NHEJ plutôt que HR6. De plus, la forme phosphorylée de l’histone H2AX et du 53BP1 peut former des foyers sur les sites des DSB. Comme ces foyers persistent jusqu’à ce que l’intégrité du double brin soit restaurée, l’évaluation de l’apparition/disparition des foyers γH2AX ou 53BP1 dans un intervalle de temps est considérée comme une méthode utile pour évaluer l’apparition et la réparation des DSB dans un système cellulaire 6,7. Cependant, selon les processus moléculaires décrits ci-dessus, étant donné que les foyers γH2AX et 53BP1 devraient co-localiser près des DSB au cours de la DDR8,9, il peut être utile de détecter simultanément la présence de ces marqueurs dans une double immunofluorescence.
Ainsi, le but de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par l’agent radiomimétique bléomycine. En utilisant la même méthodologie, nous avons également tenté de délimiter la cinétique de réparation des DSB induites par la bléomycine selon une procédure expérimentale précédemment mise en place10.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse par immunofluorescence des foyers γH2AX et 53BP1 est une méthode appropriée pour évaluer les dommages génomiques dans les noyaux interphasiques d’un système cellulaire. Cette procédure comporte plusieurs points critiques qui peuvent affecter le résultat des expériences, principalement les agents utilisés dans la fixation et la perméabilisation, le type d’anticorps et leurs facteurs de dilution, ainsi que la concentration du mutagène.
Le maintien de l’intégrité d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants aux donneurs de sang total et à tout le personnel de santé qui a prélevé les échantillons de sang.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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