Двойная иммунофлуоресценция γH2AX и 53BP1 в периферических лимфоцитах человека
Summary
В этом протоколе представлен метод оценки образования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК путем одновременного обнаружения очагов γH2AX и 53BP1 в интерфазных ядрах периферических лимфоцитов человека, обработанных блеомицином.
Abstract
Двухцепочечные разрывы (DSB) являются одним из самых тяжелых поражений, которые могут возникнуть в ядрах клеток, и, если их не восстановить, они могут привести к тяжелым последствиям, включая рак. Таким образом, клетка снабжена сложными механизмами для восстановления DSB, и эти пути включают гистон H2AX в его фосфорилированной форме в Ser-139 (а именно γH2AX) и p53-связывающий белок 1 (53BP1). Поскольку оба белка могут образовывать очаги на участках DSB, идентификация этих маркеров считается подходящим методом для изучения как DSB, так и их кинетики репарации. В соответствии с молекулярными процессами, которые приводят к образованию очагов γH2AX и 53BP1, было бы более полезно исследовать их совместную локализацию вблизи DSB, чтобы создать альтернативный подход, позволяющий количественно оценивать DSB путем одновременного обнаружения двух маркеров повреждения ДНК. Таким образом, этот протокол направлен на оценку геномного повреждения, индуцированного в лимфоцитах человека радиомиметическим агентом блеомицином из-за присутствия очагов γH2AX и 53BP1 в двойной иммунофлуоресценции. Используя эту методологию, мы также очертили изменение количества очагов γH2AX и 53BP1 с течением времени в качестве предварительной попытки изучить кинетику репарации блеомицин-индуцированных DSB.
Introduction
Повреждение ДНК постоянно индуцируется агентами, которые могут быть эндогенными, такими как АФК, образующиеся в результате клеточного окислительного метаболизма, или экзогенными, как химическими, так и физическими1. Среди наиболее вредных поражений двухцепочечные разрывы (DSB) играют фундаментальную роль, способствуя геномной нестабильности, поскольку они вызывают хромосомные аберрации, которые, в свою очередь, могут инициировать процесс канцерогенеза. Таким образом, клетки обеспечены сложными и эффективными механизмами репарацииDSB 2.
Когда возникает DSB, клетка запускает реакцию повреждения ДНК (DDR), где вместе с комплексом MRE11 / RAD50 / NBS1 рекрутируются киназы ATM или ATR для активации других белков, которые замедляют или останавливают клеточный цикл3. Важной мишенью этих киназ является гистон H2AX, который фосфорилируется на Ser-139 в пределах нескольких мегабаз от DSB (а именно γH2AX), тем самым позволяя рекрутировать несколько факторов репарации, таких как, среди прочего, BRCA1 и p53-связывающий белок 1 (53BP1)3. Позже запускается один путь между гомологичной рекомбинацией (HR), негомологичным соединением концов (NHEJ) или одноцепочечным отжигом (SSA) для восстановления DSB 4,5. Таким образом, 53BP1 участвует в диктовке выбора между HR или NHEJ, в основном способствуя активации NHEJ, а не HR6. Более того, как фосфорилированная форма гистона H2AX, так и 53BP1 могут образовывать очаги на участках DSB. Поскольку эти очаги сохраняются до тех пор, пока целостность двойной цепи не будет восстановлена, оценка появления/исчезновения очагов γH2AX или 53BP1 в течение интервала времени считается полезным методом оценки возникновения и репарации DSB в клеточной системе 6,7. Однако, согласно описанным выше молекулярным процессам, поскольку ожидается, что очаги γH2AX и 53BP1 будут локализоваться вблизи DSB во время DDR8,9, может быть полезно одновременно обнаруживать присутствие этих маркеров в двойной иммунофлуоресценции.
Таким образом, цель данной рукописи состояла в том, чтобы оценить пригодность одновременного количественного определения очагов γH2AX и 53BP1 для оценки геномных повреждений, индуцированных в периферических лимфоцитах человека радиомиметическим агентом блеомицином. Используя ту же методологию, мы также попытались очертить кинетику репарации блеомицин-индуцированных DSB в соответствии с ранее установленной экспериментальной процедурой10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммунофлуоресцентный анализ очагов γH2AX и 53BP1 является подходящим методом оценки геномных повреждений в интерфазных ядрах клеточной системы. Эта процедура имеет несколько критических моментов, которые могут повлиять на исход экспериментов, в основном, на агенты, используемые при фикс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны донорам цельной крови и всему медицинскому персоналу, который взял образцы крови.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
