Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Resumo

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Resumo

As quebras de fita dupla (DSBs) são uma das lesões mais graves que podem ocorrer nos núcleos celulares e, se não reparadas, podem levar a desfechos graves, incluindo câncer. A célula é, portanto, provida de mecanismos complexos para reparar DSBs, e essas vias envolvem histona H2AX em sua forma fosforilada em Ser-139 (ou seja, γH2AX) e proteína ligadora de p53 1 (53BP1). Como ambas as proteínas podem formar focos nos sítios dos DSBs, a identificação desses marcadores é considerada um método adequado para estudar tanto os DSBs quanto sua cinética de reparo. De acordo com os processos moleculares que levam à formação dos focos γH2AX e 53BP1, poderia ser mais útil investigar sua co-localização perto dos DSBs, a fim de estabelecer uma abordagem alternativa que permita quantificar os DSBs pela detecção simultânea de dois marcadores de dano ao DNA. Assim, este protocolo tem como objetivo avaliar o dano genômico induzido em linfócitos humanos pelo agente radiomimético bleomicina através da presença de focos γH2AX e 53BP1 em imunofluorescência dupla. Usando essa metodologia, também delineamos a variação no número de focos γH2AX e 53BP1 ao longo do tempo, como uma tentativa preliminar de estudar a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina.

Introdução

O dano ao DNA é continuamente induzido por agentes que podem ser endógenos, como as EROs geradas pelo metabolismo oxidativo celular, ou exógenos, tanto químicos quanto físicos¹. Dentre as lesões mais lesivas, as quebras de dupla fita (DSBs) têm papel fundamental na contribuição para a instabilidade genômica, uma vez que causam aberrações cromossômicas que, por sua vez, podem iniciar o processo de carcinogênese. Assim, as células são providas de mecanismos complexos e eficientes de reparo de^{DSBs 2}.

Quando ocorre um DSB, a célula desencadeia a resposta de dano ao DNA (DDR) onde, juntamente com o....

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Pisa, e consentimento informado e assinado foi obtido de cada doador.

1. Formação dos focos γH2AX e 53BP1

1. Preparação de amostras e tratamento mutagénico
   1. Coletar amostras de sangue total por punção venosa de indivíduos adultos saudáveis em tubos de coleta de sangue (por exemplo, Vacutainer) contendo heparina de lítio como anticoagulante.
   2. Para garantir a preservação adequada da amostra de sangue, inicie o procedimento em até 24 h após a amostragem.
   3. Adicionar 300 μL da amostra a um tubo contendo 4,7 mL de meio completo....

Resultados

Os dados obtidos pela análise em microscópio de fluorescência de linfócitos periféricos permitem avaliar três aspectos principais: a eficácia do tratamento com bleomicina em aumentar o número de focos γH2AX e 53BP1 (e, portanto, de DSBs) devido ao seu efeito mutagênico, em que medida ambos os focos co-localizados no local dos DSBs e o tempo-curso dos focos γH2AX e 53BP1 para delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina. Como esperado, uma frequência muito maior de focos γH2AX e 53BP1 foi observada entre.......

Discussão

A análise por imunofluorescência dos focos γH2AX e 53BP1 é um método adequado para avaliar danos genômicos em núcleos interfásicos de um sistema celular. Esse procedimento possui vários pontos críticos que podem afetar o resultado dos experimentos, principalmente, os agentes utilizados na fixação e permeabilização, o tipo de anticorpos e seus fatores de diluição, e a concentração do mutagênico.

A manutenção da integridade proteica é fundamental, uma vez que o método de imunofluorescência esper.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AlexaFluor 568 cabra anti-rato IgG (γ 1)	Invitrogen	A21124	53BP1 anticorpo secundário
Bleoprim	Sanofi		bleomicina sulfato (mutagênico)
Solução de penicilina-estreptomicina 100X	Euroclone	ECB3001D	antibióticos para meio
de cultura PBS 10X	Termofisher	14200075	solução salina tamponada com fosfato
FBS	Euroclone	EC20180L	Soro Fetal Bovino para imunofluorescência
IgG anti-coelho de cabra (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γ Anticorpo secundário H2AX
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-53BP1	Merck	MAB 3802	53BP1 anticorpo primário
Labophot 2	Nikon		Microscópio de fluorescência
P-histona H2AX (Ser139) anticorpo de coelho	Sinalização celular	#2577	&gama; Anticorpo primário H2AX
Fitohemoaglutinina	Termofisher R30852801		componente do meio de cultura
Prolongue o reagente antidesbotamento de ouro com DAPI	Cell Signaling	#8961	Solução antidesbotamento com DAPI para contracoloração
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Meio de cultura
Triton-X100	Sigma	T9284	Detergente não iônico para permeabilização