Dobbelt immunfluorescens af γH2AX og 53BP1 i humane perifere lymfocytter
Summary
Denne protokol præsenterer en metode til vurdering af dannelsen og reparationen af DNA-dobbeltstrengsbrud gennem samtidig påvisning af γH2AX og 53BP1-foci i interfasekerner af bleomycinbehandlede humane perifere lymfocytter.
Abstract
Dobbeltstrengsbrud (DSB’er) er en af de mest alvorlige læsioner, der kan forekomme i cellekerner, og hvis de ikke repareres, kan de føre til alvorlige resultater, herunder kræft. Cellen er derfor forsynet med komplekse mekanismer til reparation af DSB’er, og disse veje involverer histon H2AX i sin fosforylerede form ved Ser-139 (nemlig γH2AX) og p53-bindende protein 1 (53BP1). Da begge proteiner kan danne foci på DSB’ernes steder, betragtes identifikation af disse markører som en passende metode til at studere både DSB’er og deres reparationskinetik. Ifølge de molekylære processer, der fører til dannelsen af γH2AX og 53BP1 foci, kan det være mere nyttigt at undersøge deres co-lokalisering nær DSB’erne for at etablere en alternativ tilgang, der gør det muligt at kvantificere DSB’er ved samtidig påvisning af to DNA-skademarkører. Denne protokol sigter således mod at vurdere den genomiske skade induceret i humane lymfocytter af det radiomimetiske middel bleomycin gennem tilstedeværelsen af γH2AX og 53BP1 foci i en dobbelt immunofluorescens. Ved hjælp af denne metode afgrænsede vi også variationen i antallet af γH2AX og 53BP1 foci over tid som et indledende forsøg på at studere reparationskinetikken for bleomycin-inducerede DSB’er.
Introduction
DNA-skader induceres kontinuerligt af midler, der kan være endogene, såsom ROS genereret af cellulær oxidativ metabolisme eller eksogen, både kemikalier og fysiske1. Blandt de mest skadelige læsioner spiller dobbeltstrengsbrud (DSB’er) en grundlæggende rolle i at bidrage til genomisk ustabilitet, da de forårsager kromosomafvigelser, som igen kan initiere kræftfremkaldende proces. Således er celler forsynet med komplekse og effektive mekanismer til DSB’er, der reparerer2.
Når en DSB opstår, udløser cellen DNA-skaderespons (DDR), hvor der sammen med MRE11/RAD50/NBS1-komplekset rekrutteres ATM- eller ATR-kinaser for at aktivere andre proteiner, der bremser eller stopper cellecyklussen3. Et væsentligt mål for disse kinaser er histon H2AX, som fosforyleres på Ser-139 inden for få megabaser fra DSB’erne (nemlig γH2AX), hvilket muliggør rekruttering af flere reparationsfaktorer såsom blandt andet BRCA1 og p53-bindende protein 1 (53BP1)3. Senere udløses en vej mellem homolog rekombination (HR), ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) eller enkeltstrenget udglødning (SSA) for at reparere DSB’erne 4,5. Derfor er 53BP1 involveret i at diktere valget mellem HR eller NHEJ, primært fremme aktiveringen af NHEJ snarere end HR6. Desuden kan både den fosforylerede form af H2AX-histon og 53BP1 danne foci på DSB’ernes steder. Da disse foci vedvarer, indtil integriteten af dobbeltstrengen er genoprettet, betragtes vurdering af udseendet / forsvinden af γH2AX eller 53BP1 foci inden for et tidsinterval som en nyttig metode til at evaluere forekomsten og reparationen af DSB’er i et cellesystem 6,7. I henhold til de ovenfor beskrevne molekylære processer, da γH2AX og 53BP1-foci forventes at lokalisere sammen nær DSB’erne under DDR8,9, kan det imidlertid være nyttigt samtidig at detektere tilstedeværelsen af disse markører i en dobbelt immunofluorescens.
Formålet med dette manuskript var således at evaluere egnetheden af den samtidige kvantificering af γH2AX og 53BP1 foci til vurdering af den genomiske skade induceret i humane perifere lymfocytter af det radiomimetiske middel bleomycin. Ved hjælp af samme metode forsøgte vi også at afgrænse reparationskinetikken for bleomycin-inducerede DSB’er i henhold til en tidligere oprettet eksperimentel procedure10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofluorescensanalyse af γH2AX og 53BP1 foci er en egnet metode til vurdering af genomisk skade i interfasekerner i et cellesystem. Denne procedure har flere kritiske punkter, der kan påvirke resultatet af forsøgene, hovedsageligt de midler, der anvendes til fiksering og permeabilisering, typen af antistoffer og deres fortyndingsfaktorer og koncentrationen af mutagenet.
Vedligeholdelsen af proteinintegritet er grundlæggende, da immunofluorescensmetoden forventer at identificere antigene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige over for fuldblodsdonorerne og alt det sundhedspersonale, der tog blodprøverne.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
