मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में 53बीपी1 और 1 के दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस
Summary
यह प्रोटोकॉल ब्लीमाइसिन-उपचारित मानव परिधीय लिम्फोसाइटों के इंटरफेज नाभिक में डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के गठन और मरम्मत का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) सबसे गंभीर घावों में से एक है जो सेल नाभिक में हो सकता है, और, यदि मरम्मत नहीं की जाती है, तो वे कैंसर सहित गंभीर परिणामों का कारण बन सकते हैं। इसलिए, सेल को डीएसबी की मरम्मत के लिए जटिल तंत्र प्रदान किया जाता है, और इन मार्गों में हिस्टोन एच 2 ए एक्स को सेर -139 (अर्थात् एच 2 एएक्स) और पी 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 (53 बीपी 1) में फॉस्फोराइलेटेड रूप में शामिल किया जाता है। चूंकि दोनों प्रोटीन डीएसबी की साइटों पर फॉसी बना सकते हैं, इन मार्करों की पहचान को डीएसबी और मरम्मत के उनके कैनेटीक्स दोनों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त तरीका माना जाता है। आणविक प्रक्रियाओं के अनुसार जो कि H2AX और 53BP1 फॉसी के गठन की ओर ले जाती हैं, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए DSB के पास उनके सह-स्थानीयकरण की जांच करना अधिक उपयोगी हो सकता है जो दो डीएनए क्षति मार्करों का एक साथ पता लगाकर DSB को निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में 3H2AX और 53BP1 फॉसी की उपस्थिति के माध्यम से रेडियोमिमेटिक एजेंट ब्लीमाइसिन द्वारा मानव लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करना है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स का अध्ययन करने के प्रारंभिक प्रयास के रूप में, समय के साथ 3H2AX और 53BP1 फॉसी की संख्या में भिन्नता को भी चित्रित किया।
Introduction
डीएनए क्षति लगातार एजेंटों द्वारा प्रेरित होती है जो अंतर्जात हो सकते हैं, जैसे कि सेलुलर ऑक्सीडेटिव चयापचय द्वारा उत्पन्न आरओएस, या बहिर्जात, रसायन और भौतिकदोनों 1। सबसे हानिकारक घावों में, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) जीनोमिक अस्थिरता में योगदान करने में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं, क्योंकि वे क्रोमोसोम विपथन का कारण बनते हैं जो बदले में कार्सिनोजेनेसिस प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं। इस प्रकार, कोशिकाओं को डीएसबी मरम्मत के जटिल और कुशल तंत्रप्रदान किए जाते हैं।
जब डीएसबी होता है, तो कोशिका डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) को ट्रिगर करती है, जहां एमआरई 11 / आरएडी 50 / एनबीएस 1 कॉम्प्लेक्स के साथ, एटीएम या एटीआर किनेसेस को अन्य प्रोटीनों को सक्रिय करने के लिए भर्ती किया जाता है जो सेल चक्र3 को धीमा या रोकते हैं। इन किनेसेस का एक आवश्यक लक्ष्य हिस्टोन एच 2 ए एक्स है, जो डीएसबी से कुछ मेगाबेस के भीतर सेर -139 पर फॉस्फोराइलेटेड है (अर्थात् एच 2 एएक्स), जिससे कई मरम्मत कारकों की भर्ती की अनुमति मिलती है, जैसे कि दूसरों के बीच, बीआरसीए 1 और पी 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 (53 बीपी 1)3। बाद में, डीएसबी 4,5 की मरम्मत के लिए होमोलोगस पुनर्संयोजन (एचआर), गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे), या सिंगल-स्ट्रैंड एनीलिंग (एसएसए) के बीच एक मार्ग शुरू किया जाता है। इसलिए, 53BP1 HR या NHEJ के बीच चयन को निर्धारित करने में शामिल है, मुख्य रूप से HR6 के बजाय NHEJ के सक्रियण को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, एच 2 ए एक्स हिस्टोन और 53 बीपी 1 के फॉस्फोराइलेटेड रूप दोनों डीएसबी की साइटों पर फॉसी बना सकते हैं। चूंकि ये फॉसी तब तक बनी रहती हैं जब तक कि डबल स्ट्रैंड की अखंडता बहाल नहीं हो जाती है, एक समय अंतराल के भीतर 3H2AX या 53BP1 फॉसी की उपस्थिति / गायब होने का आकलन करना सेल सिस्टम 6,7 में DSB की घटना और मरम्मत का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तरीका माना जाता है। हालांकि, ऊपर वर्णित आणविक प्रक्रियाओं के अनुसार, चूंकि डीडीआर8,9 के दौरान डीएसबी के पास 5एच2एएक्स और 53बीपी1 फॉसी के सह-स्थानीयकरण की उम्मीद है, इसलिए दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में इन मार्करों की उपस्थिति का समवर्ती रूप से पता लगाना उपयोगी हो सकता है।
इस प्रकार, इस पांडुलिपि का उद्देश्य रेडियोमिमेटिक एजेंट ब्लीमाइसिन द्वारा मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए एक साथ परिमाणीकरण की उपयुक्तता का मूल्यांकन करना था। उसी पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने पहले से स्थापित प्रयोगात्मक प्रक्रिया10 के अनुसार ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स को चित्रित करने का भी प्रयास किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सेल सिस्टम के इंटरफेज नाभिक में जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त विधि है। इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं जो प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, मुख्य रूप से, निर्धारण और…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पूरे रक्तदाताओं और सभी स्वास्थ्य कर्मियों के आभारी हैं जिन्होंने रक्त के नमूने लिए।
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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