JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Generatie van Centromeer-geassocieerde proteïne-E CENP-E-/- knock-outcellijnen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Dit artikel rapporteert de constructie van centromeer-geassocieerde proteïne-E (CENP-E) knock-outcellen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem en drie op fenotype gebaseerde screeningstrategieën. We hebben de CENP-E knock-out cellijn gebruikt om een nieuwe benadering vast te stellen om de specificiteit en toxiciteit van de CENP-E-remmers te valideren, wat nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en biologisch onderzoek.

Abstract

Het CRISPR-systeem (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 systeem is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor nauwkeurige en efficiënte genbewerking in een verscheidenheid aan organismen. Centromeer-geassocieerd eiwit-E (CENP-E) is een plus-end-gerichte kinesine die nodig is voor het vangen van kinetochoor-microtubuli, chromosoomuitlijning en controlepunt van de spoelassemblage. Hoewel de cellulaire functies van de CENP-E-eiwitten goed zijn bestudeerd, was het moeilijk om de directe functies van CENP-E-eiwitten te bestuderen met behulp van traditionele protocollen, omdat CENP-E-ablatie meestal leidt tot activering van het controlepunt van de spoelassemblage, stopzetting van de celcyclus en celdood. In deze studie hebben we het CENP-E-gen in menselijke HeLa-cellen volledig uitgeschakeld en met succes de CENP-E-/- HeLa-cellen gegenereerd met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem.

Er werden drie geoptimaliseerde op fenotypen gebaseerde screeningstrategieën vastgesteld, waaronder screening van celkolonies, fenotypes van chromosoomuitlijning en de fluorescerende intensiteiten van CENP-E-eiwitten, die de screeningsefficiëntie en het experimentele slagingspercentage van de CENP-E-knock-outcellen effectief verbeteren. Belangrijk is dat CENP-E-deletie resulteert in chromosoommislijning, de abnormale locatie van de BUB1 mitotische checkpoint serine/threonine kinase B (BubR1)-eiwitten en mitotische defecten. Verder hebben we het CENP-E knock-out HeLa-celmodel gebruikt om een identificatiemethode voor CENP-E-specifieke remmers te ontwikkelen.

In deze studie is een bruikbare benadering vastgesteld om de specificiteit en toxiciteit van CENP-E-remmers te valideren. Bovendien presenteert dit artikel de protocollen van CENP-E-genbewerking met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem, wat een krachtig hulpmiddel zou kunnen zijn om de mechanismen van CENP-E in celdeling te onderzoeken. Bovendien zou de CENP-E knock-out cellijn bijdragen aan de ontdekking en validatie van CENP-E-remmers, die belangrijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van antitumorgeneesmiddelen, studies van celdelingsmechanismen in de celbiologie en klinische toepassingen.

Introduction

Gemanipuleerde genoombewerking bemiddelt de gerichte modificaties van genen in een verscheidenheid aan cellen en organismen. In eukaryoten kan plaatsspecifieke mutagenese worden geïntroduceerd door de toepassing van sequentiespecifieke nucleasen die homologe recombinatie van doelwit-DNAstimuleren 1. In de afgelopen jaren zijn verschillende genoombewerkingstechnologieën, waaronder zinkvingernucleasen (ZFN’s)2,3, transcriptieactivatorachtige effectornucleasen (TALEN’s)4,5 en homing-meganucleasen 6,7, ontwikkeld om genomen op specifieke plaatsen te splitsen, maar deze benaderingen vereisen complexe eiwitengineering en overbodige experimentele procedures. Studies hebben aangetoond dat het type II prokaryotisch geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/Cas-systeem een efficiënte genbewerkingstechnologie is, die specifiek RNA-geleide, plaatsspecifieke DNA-splitsing bemiddelt in een grote verscheidenheid aan cellen en soorten 8,9,10,11. De CRISPR/Cas9-gen-knock-outtechnologie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van basisbiologie, biotechnologie en geneeskunde12.

Bacteriën en de meeste archaea hebben een op RNA gebaseerd adaptief immuunsysteem ontwikkeld dat CRISPR- en Cas-eiwitten gebruikt om virussen en plasmiden te identificeren en tevernietigen. Pyogenes van Streptococcus Cas9 (SpCas9) endonuclease bevat het RuvC-achtige Holliday junction resolvase (RuvC) en His-Asn-His (HNH) domein, dat sequentiespecifieke, dubbelstrengs breuken (DSB’s) efficiënt kan mediëren door een synthetisch single-guide RNA (sgRNA) te leveren dat CRISPR-RNA’s (crRNA) en transactiverend crRNA (tracrRNA) bevat14,15,16. DSB’s kunnen worden gerepareerd via de indelvormende niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologiegerichte reparatie (HDR)-route, die meerdere mutaties introduceert, waaronder inserties, deleties of littekenloze substituties met één nucleotide, in zoogdiercellen 1,8. Zowel de foutgevoelige NHEJ als de high-fidelity HDR-route kunnen worden gebruikt om gen-knock-out te mediëren door inserties of deleties, wat frameshift-mutaties en voortijdige stopcodons kan veroorzaken10.

Kinesine-7 CENP-E is vereist voor de aanhechting van kinetochoor-microtubuli en chromosoomuitlijning tijdens celdeling 17,18,19. Antilichaammicro-injectie 20,21, siRNA-depletie22,23, chemische remming 24,25,26 en genetische deletie 27,28,29 van CENP-E leidt tot chromosoomafwijking, de activering van het controlepunt van de spoelassemblage en mitotische defecten, wat resulteert in aneuploïdie en chromosomale instabiliteit 19,30. Bij muizen resulteert CENP-E-deletie in abnormale ontwikkeling en embryonale letaliteit in de zeer vroege stadia van ontwikkeling 27,29,31. Genetische deletie van CENP-E leidt meestal tot een verkeerde uitlijning van chromosomen en celdood 26,27,29, wat een obstakel vormt bij het bestuderen van de functies en mechanismen van de CENP-E-eiwitten.

Een recente studie heeft een voorwaardelijke CENP-E knock-out cellijn vastgesteld met behulp van een Auxine-induceerbare CRISPR/Cas9-genbewerkingsmethode32, die een snelle afbraak van CENP-E-eiwitten in relatief korte tijd mogelijk maakt33. Tot op heden zijn er echter geen stabiele CENP-E knock-out cellijnen tot stand gebracht, wat een onopgeloste technische uitdaging is in de CENP-E-biologie. Gezien genetische robuustheid34, genetische compensatieresponsen 35,36,37 en complexe intracellulaire omgevingen, aangezien de directe gevolgen van volledige deletie van CENP-E complex en onvoorspelbaar kunnen zijn, is het belangrijk om CENP-E knock-outcellijnen vast te stellen voor het onderzoek naar mechanismen van chromosoomuitlijning, controlepunt van de spindelassemblage en stroomafwaartse signaalroutes.

De ontdekking en toepassingen van CENP-E-remmers zijn belangrijk voor de behandeling van kanker. Tot op heden zijn zeven soorten CENP-E-remmers gevonden en gesynthetiseerd, waaronder GSK923295 en zijn derivaten24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pyridinesteigerderivaten40,41, verbinding-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 en benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazoolderivaten47. Onder deze remmers is GSK923295 een allosterische en efficiënte CENP-E-remmer die zich bindt aan het motorische domein van CENP-E en CENP-E microtubuli-gestimuleerde ATPase-activiteit remt met een Ki van 3,2 ± 0,2 nM24,25. Vergeleken met de remmende effecten van GSK923295 op gekweekte kankercellen, zijn de therapeutische effecten van GSK923295 bij klinische kankerpatiënten echter niet ideaal48,49, wat ook aanleiding gaf tot bezorgdheid over de specificiteit van GSK923295 voor CENP-E. Bovendien zijn de specificiteit en bijwerkingen van andere CENP-E-remmers op de CENP-E-eiwitten belangrijke kwesties in kankeronderzoek.

In deze studie hebben we het CENP-E-gen in HeLa-cellen volledig uitgeschakeld met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem. Er zijn drie geoptimaliseerde op fenotypen gebaseerde screeningstrategieën vastgesteld, waaronder screening van celkolonies, fenotypes van chromosoomuitlijning en de fluorescerende intensiteiten van CENP-E-eiwitten, om de screeningefficiëntie en het slagingspercentage van CENP-E-genbewerking te verbeteren. Bovendien kunnen CENP-E knock-out cellijnen worden gebruikt om de specificiteit van kandidaat-verbindingen voor CENP-E te testen.

Protocol

1. Constructie van de CRISPR/Cas9 gen knock-out vectoren Selecteer de genomische doel-DNA-sequentie op het humane CENP-E-gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) en ontwerp het sgRNA met behulp van een online CRISPR-ontwerptool (http://crispor.tefor.net/). Voer een enkele genomische sequentie in, selecteer het genoom van “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNP’s): dbSNP148”, en selecteer het protospacer aangrenze…

Representative Results

De CENP-E-/- HeLa-cellen zijn met succes gegenereerd met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem (Figuur 1). De tijdlijn en de kritische experimentele stappen van deze methode zijn weergegeven in figuur 1. Eerst hebben we de CENP-E-specifieke sgRNA’s ontworpen en gesynthetiseerd, de sgRNA’s gegloeid en geligeerd in het pX458-plasmide, het plasmide getransfecteerd in HeLa-cellen en ze gedurende 48 uur gekweekt. De getransfecteerde cellen w…

Discussion

Kinesine-7 CENP-E is een belangrijke regulator in de uitlijning van chromosomen en het controlepunt van de spoelassemblage tijdens celdeling 17,19,20. Genetische deletie van CENP-E resulteert meestal in de activering van het controlepunt van de spindelassemblage, het stoppen van de celcyclus en celdood 27,29,51,52.<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken alle leden van het Cytoskeleton Laboratory van de Fujian Medical University voor nuttige discussies. We danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin en Min-Xia Wu van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor hun technische assistentie. We danken Si-Yi Zheng, Ying Lin en Qi Ke van het Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences aan de Fujian Medical University voor hun steun. Deze studie werd ondersteund door de volgende subsidies: National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82001608 en 82101678), Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (subsidienummer 2019J05071), de Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, de provincie Fujian, China (subsidienummer 2021Y9160) en Fujian Medical University high-level talents scientific research start-up funding project (subsidienummer XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell’s functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Keywords: CENP-ECRISPR/Cas9KnockoutHeLa CellsChromosome AlignmentMitotic DefectsCell Cycle ArrestCell DeathKinetochore-microtubule CaptureSpindle Assembly Checkpoint
check_url/65476?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image