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Biology

Generazione di linee cellulari knockout CENP-E-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Questo articolo riporta la costruzione di cellule knockout della proteina E associata al centromero (CENP-E) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e tre strategie di screening basate sul fenotipo. Abbiamo utilizzato la linea cellulare knockout CENP-E per stabilire un nuovo approccio per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori CENP-E, utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica.

Abstract

Il sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 è emerso come un potente strumento per l’editing genetico preciso ed efficiente in una varietà di organismi. La proteina-E ASSOCIATA AL CENTROMERO (CENP-E) è una chinesina diretta all’estremità positiva necessaria per la cattura del cinetocoro-microtubuli, l’allineamento cromosomico e il checkpoint dell’assemblaggio del fuso. Sebbene le funzioni cellulari delle proteine CENP-E siano state ben studiate, è stato difficile studiare le funzioni dirette delle proteine CENP-E utilizzando i protocolli tradizionali perché l’ablazione di CENP-E di solito porta all’attivazione del checkpoint dell’assemblaggio del fuso, all’arresto del ciclo cellulare e alla morte cellulare. In questo studio, abbiamo completamente eliminato il gene CENP-E nelle cellule HeLa umane e generato con successo le cellule CENP-E-/- HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9.

Sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, i fenotipi di allineamento cromosomico e le intensità fluorescenti delle proteine CENP-E, che migliorano efficacemente l’efficienza dello screening e il tasso di successo sperimentale delle cellule knockout CENP-E . È importante sottolineare che la delezione di CENP-E provoca il disallineamento cromosomico, la posizione anomala delle proteine serina/treonina chinasi B (BubR1) del checkpoint mitotico BUB1 e difetti mitotici. Inoltre, abbiamo utilizzato il modello di cellula HeLa knockout di CENP-E per sviluppare un metodo di identificazione per inibitori specifici di CENP-E.

In questo studio è stato stabilito un approccio utile per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori di CENP-E. Inoltre, questo articolo presenta i protocolli di editing genetico CENP-E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, che potrebbe essere un potente strumento per studiare i meccanismi di CENP-E nella divisione cellulare. Inoltre, la linea cellulare knockout di CENP-E contribuirebbe alla scoperta e alla convalida degli inibitori di CENP-E, che hanno importanti implicazioni per lo sviluppo di farmaci antitumorali, studi sui meccanismi di divisione cellulare nella biologia cellulare e applicazioni cliniche.

Introduction

L’editing genomico ingegnerizzato media le modificazioni mirate dei geni in una varietà di cellule e organismi. Negli eucarioti, la mutagenesi sito-specifica può essere introdotta dall’applicazione di nucleasi sequenza-specifiche che stimolano la ricombinazione omologa del DNAbersaglio 1. Negli ultimi anni, diverse tecnologie di editing del genoma, tra cui le nucleasi a dita di zinco (ZFNs)2,3, le nucleasi effettrici simili all’attivatore di trascrizione (TALEN)4,5 e le meganucleasi homing 6,7, sono state progettate per scindere i genomi in siti specifici, ma questi approcci richiedono una complessa ingegneria proteica e procedure sperimentali ridondanti. Gli studi hanno dimostrato che il sistema CRISPR (Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) procariotico di tipo II è una tecnologia di editing genetico efficiente, che media specificamente la scissione del DNA guidata dall’RNA e sito-specifica in un’ampia varietà di cellule e specie 8,9,10,11. La tecnologia di knockout genico CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato i campi della biologia di base, della biotecnologia e della medicina12.

I batteri e la maggior parte degli archaea hanno sviluppato un sistema immunitario adattativo basato sull’RNA che utilizza le proteine CRISPR e Cas per identificare e distruggere virus e plasmidi13. Streptococcus pyogenes L’endonucleasi Cas9 (SpCas9) contiene la risoluvasi della giunzione di Holliday simile a RuvC (RuvC) e il dominio His-Asn-His (HNH), che possono mediare in modo efficiente le rotture a doppio filamento (DSB) specifiche della sequenza fornendo un RNA sintetico a guida singola (sgRNA) contenente RNA CRISPR (crRNA) e crRNA transattivante (tracrRNA)14,15,16 . I DSB possono essere riparati attraverso la via di giunzione non omologa (NHEJ) o di riparazione diretta all’omologia (HDR), che introduce mutazioni multiple, tra cui inserzioni, delezioni o sostituzioni a singolo nucleotide senza cicatrici, nelle cellule di mammifero 1,8. Sia l’NHEJ soggetto a errori che la via HDR ad alta fedeltà possono essere utilizzati per mediare il knockout genico attraverso inserzioni o delezioni, che possono causare mutazioni frameshift e codoni di stop prematuri10.

La chinesina-7 CENP-E è necessaria per l’attacco del cinetocoro-microtubulo e l’allineamento cromosomico durante la divisione cellulare 17,18,19. La microiniezione di anticorpi20,21, la deplezione di siRNA22,23, l’inibizione chimica 24,25,26 e la delezione genetica 27,28,29 di CENP-E portano al disallineamento cromosomico, all’attivazione del checkpoint dell’assemblaggio del fuso e ai difetti mitotici, che si traducono in aneuploidia e instabilità cromosomica 19,30. Nei topi, la delezione di CENP-E provoca uno sviluppo anomalo e la letalità embrionale nelle primissime fasi dello sviluppo 27,29,31. La delezione genetica di CENP-E di solito porta al disallineamento cromosomico e alla morte cellulare 26,27,29, che è un ostacolo nello studio delle funzioni e dei meccanismi delle proteine CENP-E.

Uno studio recente ha stabilito una linea cellulare knockout condizionale di CENP-E utilizzando un metodo di editing genetico CRISPR/Cas9 inducibile dall’auxina32, che consente una rapida degradazione delle proteine CENP-E in un tempo relativamente breve33. Tuttavia, ad oggi, non sono state stabilite linee cellulari knockout stabili per CENP-E, il che rappresenta una sfida tecnica irrisolta nella biologia del CENP-E. Considerando la robustezza genetica34, le risposte di compensazione genetica 35,36,37 e gli ambienti intracellulari complessi, poiché le conseguenze dirette della delezione completa di CENP-E possono essere complesse e imprevedibili, è importante stabilire linee cellulari knockout CENP-E per lo studio dei meccanismi di allineamento cromosomico, checkpoint dell’assemblaggio del fuso e vie di segnalazione a valle.

La scoperta e le applicazioni degli inibitori di CENP-E sono importanti per il trattamento del cancro. Ad oggi, sono stati trovati e sintetizzati sette tipi di inibitori di CENP-E, tra cui GSK923295 e i suoi derivati24,25, PF-277138,39, derivati dell’impalcatura imidazo[1,2-a]piridina40,41, composto-A42,43, sintelina44,45, UA6278446 e derivati benzo[d]pirrolo[2,1-b]tiazolo47. Tra questi inibitori, GSK923295 è un inibitore allosterico ed efficiente di CENP-E che si lega al dominio motorio di CENP-E e inibisce l’attività dell’ATPasi stimolata dai microtubuli di CENP-E con un Ki di 3,2 ± 0,2 nM24,25. Tuttavia, rispetto agli effetti inibitori della GSK923295 sulle cellule tumorali in coltura, gli effetti terapeutici della GSK923295 nei pazienti oncologici clinici non sono ideali48,49, il che ha anche sollevato preoccupazioni sulla specificità della GSK923295 per CENP-E. Inoltre, la specificità e gli effetti collaterali di altri inibitori di CENP-E sulle proteine CENP-E sono questioni chiave nella ricerca sul cancro.

In questo studio, abbiamo completamente eliminato il gene CENP-E nelle cellule HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. Sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, i fenotipi di allineamento cromosomico e le intensità fluorescenti delle proteine CENP-E, per migliorare l’efficienza dello screening e il tasso di successo dell’editing genetico CENP-E. Inoltre, le linee cellulari knockout di CENP-E possono essere utilizzate per testare la specificità dei composti candidati per CENP-E.

Protocol

1. Costruzione dei vettori di knockout del gene CRISPR/Cas9 Selezionare la sequenza di DNA genomico bersaglio sul gene umano CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e progettare l’sgRNA utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR online (http://crispor.tefor.net/). Inserire una singola sequenza genomica, selezionare il genoma di “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs): dbSNP148”, e selezionare il mo…

Representative Results

Le cellule CENP-E-/- HeLa sono state generate con successo utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). La tempistica e le fasi sperimentali critiche di questo metodo sono mostrate nella Figura 1. In primo luogo, abbiamo progettato e sintetizzato gli sgRNA specifici per CENP-E, ricotto e legato gli sgRNA nel plasmide pX458, trasfettato il plasmide in cellule HeLa e coltivate per 48 ore. Le cellule trasfettate sono state dissociate …

Discussion

Kinesin-7 CENP-E è un regolatore chiave nell’allineamento cromosomico e nel checkpoint dell’assemblaggio del fuso durante la divisione cellulare 17,19,20. La delezione genetica di CENP-E di solito provoca l’attivazione del checkpoint dell’assemblaggio del fuso, l’arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare 27,29,51,52.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Citoscheletro dell’Università di Medicina del Fujian per le utili discussioni. Ringraziamo Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke del Centro di Insegnamento Sperimentale di Scienze Mediche di Base presso l’Università di Medicina del Fujian per il loro supporto. Questo studio è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 82001608 e 82101678), Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (numero di sovvenzione 2019J05071), i fondi congiunti per l’innovazione della scienza e della tecnologia, la provincia del Fujian, Cina (numero di sovvenzione 2021Y9160) e il progetto di finanziamento per la ricerca scientifica di talenti di alto livello della Fujian Medical University (numero di sovvenzione XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
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References

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
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