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Biology

Generación de líneas celulares knockout de proteína E CENP-E-/- asociadas al centrómero utilizando el sistema CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

En este artículo se informa de la construcción de células knockout de proteína E asociada al centrómero (CENP-E) utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y tres estrategias de cribado basadas en el fenotipo. Hemos utilizado la línea celular knockout CENP-E para establecer un enfoque novedoso para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E, que es útil para el desarrollo de fármacos y la investigación biológica.

Abstract

El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas)/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para la edición genética precisa y eficiente en una variedad de organismos. La proteína E ASOCIADA AL CENTRÓMERO (CENP-E) es una quinesina dirigida al extremo positivo necesaria para la captura del cinetocoro-microtúbulo, la alineación cromosómica y el punto de control de ensamblaje del huso. Aunque las funciones celulares de las proteínas CENP-E han sido bien estudiadas, ha sido difícil estudiar las funciones directas de las proteínas CENP-E utilizando protocolos tradicionales porque la ablación de CENP-E generalmente conduce a la activación del punto de control del ensamblaje del huso, la detención del ciclo celular y la muerte celular. En este estudio, hemos eliminado por completo el gen CENP-E en células HeLa humanas y hemos generado con éxito las células CENP-E-/- HeLa utilizando el sistema CRISPR/Cas9.

Se establecieron tres estrategias optimizadas de cribado basadas en el fenotipo, que incluyen el cribado de colonias celulares, los fenotipos de alineación cromosómica y las intensidades fluorescentes de las proteínas CENP-E, que mejoran eficazmente la eficacia del cribado y la tasa de éxito experimental de las células knockout CENP-E . Es importante destacar que la deleción de CENP-E da lugar a una desalineación cromosómica, a la localización anormal de las proteínas serina/treonina quinasa B (BubR1) del punto de control mitótico BUB1 y a defectos mitóticos. Además, hemos utilizado el modelo de células HeLa knockout de CENP-E para desarrollar un método de identificación de inhibidores específicos de CENP-E.

En este estudio, se ha establecido un enfoque útil para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E. Además, en este trabajo se presentan los protocolos de edición génica de CENP-E utilizando el sistema CRISPR/Cas9, que podría ser una poderosa herramienta para investigar los mecanismos de CENP-E en la división celular. Además, la línea celular knockout de CENP-E contribuiría al descubrimiento y validación de inhibidores de CENP-E, que tienen importantes implicaciones para el desarrollo de fármacos antitumorales, estudios de mecanismos de división celular en biología celular y aplicaciones clínicas.

Introduction

La edición genómica modificada media las modificaciones específicas de los genes en una variedad de células y organismos. En eucariotas, la mutagénesis específica del sitio puede introducirse mediante la aplicación de nucleasas específicas de secuencia que estimulan la recombinación homóloga del ADN diana1. En los últimos años, se han diseñado varias tecnologías de edición del genoma, incluidas las nucleasas de dedos de zinc (ZFN)2,3, las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN)4,5 y las meganucleasas homing 6,7, para escindir genomas en sitios específicos, pero estos enfoques requieren ingeniería de proteínas compleja y procedimientos experimentales redundantes. Los estudios han demostrado que el sistema de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/Cas agrupadas regularmente interespaciadas de tipo II es una tecnología eficiente de edición de genes, que media específicamente la escisión del ADN guiada por ARN y específica del sitio en una amplia variedad de células y especies 8,9,10,11. La tecnología de knockout del gen CRISPR/Cas9 ha revolucionado los campos de la biología básica, la biotecnología y la medicina12.

Las bacterias y la mayoría de las arqueas han desarrollado un sistema inmunitario adaptativo basado en ARN que utiliza proteínas CRISPR y Cas para identificar y destruir virus y plásmidos. Streptococcus pyogenes La endonucleasa Cas9 (SpCas9) contiene la resolvasa de la unión Holliday similar a RuvC (RuvC) y el dominio His-Asn-His (HNH), que puede mediar de manera eficiente las roturas de doble cadena (DSB) específicas de la secuencia al proporcionar un ARN sintético de guía única (sgRNA) que contiene ARN CRISPR (crRNA) y crRNA transactivador (tracrRNA)14,15,16. Los DSB pueden ser reparados a través de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o de reparación dirigida por homología (HDR) que forma indel, que introduce múltiples mutaciones, incluyendo inserciones, deleciones o sustituciones de un solo nucleótido sin cicatrices, en células de mamíferos 1,8. Tanto la vía NHEJ, propensa a errores, como la vía HDR de alta fidelidad se pueden utilizar para mediar en la eliminación de genes a través de inserciones o deleciones, lo que puede causar mutaciones de cambio de marco y codones de parada prematuros10.

La kinesina-7 CENP-E es necesaria para la unión cinetocoro-microtúbulos y la alineación cromosómica durante la división celular 17,18,19. La microinyección de anticuerpos20,21, la depleción de siRNA22,23, la inhibición química 24,25,26 y la deleción genética 27,28,29 de CENP-E conducen a la desalineación cromosómica, la activación del punto de control del ensamblaje del huso y defectos mitóticos, lo que resulta en aneuploidía e inestabilidad cromosómica 19,30. En ratones, la deleción de CENP-E resulta en un desarrollo anormal y letalidad embrionaria en las primeras etapas del desarrollo 27,29,31. La deleción genética de CENP-E generalmente conduce a la desalineación cromosómica y a la muerte celular 26,27,29, lo que constituye un obstáculo para el estudio de las funciones y mecanismos de las proteínas CENP-E.

Un estudio reciente ha establecido una línea celular knockout condicional de CENP-E utilizando un método de edición génica CRISPR/Cas9 inducible por auxinas32, que permite una rápida degradación de las proteínas CENP-E en un tiempo relativamente corto33. Sin embargo, hasta la fecha, no se han establecido líneas celulares estables de CENP-E knockout, lo cual es un desafío técnico no resuelto en la biología de CENP-E. Teniendo en cuenta la robustez genética34, las respuestas de compensación genética 35,36,37 y los entornos intracelulares complejos, ya que las consecuencias directas de la deleción completa de CENP-E pueden ser complejas e impredecibles, es importante establecer líneas celulares knockout de CENP-E para la investigación de los mecanismos de alineación cromosómica, el punto de control del ensamblaje del huso y las vías de señalización posteriores.

El descubrimiento y las aplicaciones de los inhibidores de CENP-E son importantes para el tratamiento del cáncer. Hasta la fecha, se han encontrado y sintetizado siete tipos de inhibidores de CENP-E, incluyendo GSK923295 y sus derivados24,25, PF-2771 38,39, imidazo[1,2-a]piridina derivados de andamios 40,41, compuestoA 42,43, sintelina44,45, UA6278446 y derivados de benzo[d]pirrolo[2,1-b]tiazol47. Entre estos inhibidores, GSK923295 es un inhibidor alostérico y eficiente de CENP-E que se une al dominio motor de CENP-E e inhibe la actividad de la ATPasa estimulada por microtúbulos de CENP-E con una Ki de 3,2 ± 0,2 nM24,25. Sin embargo, en comparación con los efectos inhibidores de la GSK923295 en células cancerosas cultivadas, los efectos terapéuticos de la GSK923295 en pacientes clínicos con cáncer no son ideales48,49, lo que también planteó preocupaciones sobre la especificidad de la GSK923295 para CENP-E. Además, la especificidad y los efectos secundarios de otros inhibidores de CENP-E sobre las proteínas CENP-E son cuestiones clave en la investigación del cáncer.

En este estudio, hemos eliminado por completo el gen CENP-E en células HeLa utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Se han establecido tres estrategias optimizadas de cribado basadas en el fenotipo, que incluyen el cribado de colonias celulares, los fenotipos de alineación cromosómica y las intensidades fluorescentes de las proteínas CENP-E, para mejorar la eficacia del cribado y la tasa de éxito de la edición génica CENP-E. Además, las líneas celulares knockout de CENP-E se pueden utilizar para probar la especificidad de los compuestos candidatos para CENP-E.

Protocol

1. Construcción de los vectores knockout del gen CRISPR/Cas9 Seleccione la secuencia de ADN genómico diana en el gen CENP-E humano (Acceso GenBank No. NM_001286734.2) y diseñar el sgRNA utilizando una herramienta de diseño CRISPR en línea (http://crispor.tefor.net/). Introduzca una sola secuencia genómica, seleccione el genoma de “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análisis hg38) + polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs): dbSNP148”, y seleccione…

Representative Results

Las células CENP-E-/- HeLa se generaron con éxito utilizando el sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). La línea de tiempo y los pasos experimentales críticos de este método se muestran en la Figura 1. En primer lugar, diseñamos y sintetizamos los sgRNAs específicos de CENP-E, recocimos y ligamos los sgRNAs en el plásmido pX458, transfectamos el plásmido en células HeLa y las cultivamos durante 48 h. Las células transfectadas se d…

Discussion

La quinesina-7 CENP-E es un regulador clave en la alineación cromosómica y el punto de control de ensamblaje del huso durante la división celular 17,19,20. La deleción genética de CENP-E generalmente resulta en la activación del punto de control del ensamblaje del huso, la detención del ciclo celular y la muerte celular 27,29,51,52.</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio de Citoesqueletos de la Universidad Médica de Fujian por sus útiles discusiones. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin y Min-Xia Wu del Centro de Servicios Públicos de Tecnología de la Universidad Médica de Fujian por su asistencia técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin y Qi Ke del Centro de Enseñanza Experimental de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad Médica de Fujian por su apoyo. Este estudio contó con el apoyo de las siguientes subvenciones: Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención número 82001608 y 82101678), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian, China (subvención número 2019J05071), los Fondos Conjuntos para la Innovación de la Ciencia y la Tecnología, la provincia de Fujian, China (subvención número 2021Y9160) y el proyecto de financiación de la investigación científica de alto nivel de talentos de la Universidad Médica de Fujian (número de subvención XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
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References

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
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