JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Генерация центромер-ассоциированных белков-E CENP-E-/- нокаутных клеточных линий с использованием системы CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

В данной статье сообщается о построении центромер-ассоциированных протеин-Е (CENP-E) нокаутных клеток с использованием системы CRISPR/Cas9 и трех стратегий скрининга на основе фенотипа. Мы использовали линию нокаутных клеток CENP-E для разработки нового подхода к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E, что полезно для разработки лекарств и биологических исследований.

Abstract

Система CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9 стала мощным инструментом для точного и эффективного редактирования генов у различных организмов. Центромер-ассоциированный белок-Е (CENP-E) представляет собой положительно-концевой кинезин, необходимый для захвата кинетохорных микротрубочек, выравнивания хромосом и контрольной точки сборки веретена. Несмотря на то, что клеточные функции белков CENP-E были хорошо изучены, было трудно изучить прямые функции белков CENP-E с использованием традиционных протоколов, поскольку абляция CENP-E обычно приводит к активации контрольной точки сборки веретена, остановке клеточного цикла и гибели клеток. В этом исследовании мы полностью нокаутировали ген CENP-E в клетках HeLa человека и успешно сгенерировали клетки CENP-E-/- HeLa с помощью системы CRISPR/Cas9.

Были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга на основе фенотипа, включая скрининг клеточных колоний, фенотипы выравнивания хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP-E, которые эффективно повышают эффективность скрининга и успешность экспериментов нокаутных клеток CENP-E . Важно отметить, что делеция CENP-E приводит к рассогласованию хромосом, аномальному расположению белков серин/треонинкиназы B (BubR1) митотической контрольной точки BUB1 и митотическим дефектам. Кроме того, мы использовали модель нокаута клеток HeLa CENP-E для разработки метода идентификации специфических ингибиторов CENP-E.

В этом исследовании был разработан полезный подход к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E. Кроме того, в данной работе представлены протоколы редактирования генов CENP-E с использованием системы CRISPR/Cas9, которые могут стать мощным инструментом для исследования механизмов деления клеток CENP-E. Кроме того, линия нокаутных клеток CENP-E будет способствовать открытию и валидации ингибиторов CENP-E, которые имеют важное значение для разработки противоопухолевых препаратов, изучения механизмов клеточного деления в клеточной биологии и клинического применения.

Introduction

Инженерное редактирование генома опосредует целенаправленные модификации генов в различных клетках и организмах. У эукариот сайт-специфический мутагенез может быть введен путем применения последовательно-специфических нуклеаз, которые стимулируют гомологичную рекомбинациюДНК-мишени 1. В последние годы было разработано несколько технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs)2,3, эффекторные нуклеазы активатора транскрипции (TALENs)4,5 и самонаводящиеся мегануклеазы 6,7, но эти подходы требуют сложной белковой инженерии и избыточных экспериментальных процедур. Исследования показали, что кластеризованная прокариотическая система с регулярными интервальными короткими палиндромными повторами (CRISPR)/Cas II типа является эффективной технологией редактирования генов, которая специфически опосредует РНК-управляемое, сайт-специфическое расщепление ДНК в широком спектре клеток и видов 8,9,10,11. Технология нокаута генов CRISPR/Cas9 произвела революцию в области фундаментальной биологии, биотехнологиии медицины.

Бактерии и большинство архей развили адаптивную иммунную систему на основе РНК, которая использует белки CRISPR и Cas для идентификации и уничтожениявирусов и плазмид. Streptococcus pyogenes Эндонуклеаза Cas9 (SpCas9) содержит RuvC-подобную резольвазу перехода Холлидея (RuvC) и домен His-Asn-His (HNH), которые могут эффективно опосредуть последовательно-специфичные двухцепочечные разрывы (DSB), обеспечивая синтетическую однонаправляющую РНК (sgRNA), содержащую CRISPR-РНК (crRNA) и транс-активирующую crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB могут быть репарированы с помощью индел-образующего пути негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологии-направленной репарации (HDR), который приводит к множественным мутациям, включая вставки, делеции или однонуклеотидные замены без рубцов, в клетках млекопитающих 1,8. Как подверженный ошибкам NHEJ, так и высокоточный HDR-путь могут быть использованы для опосредования нокаута генов путем вставок или делеций, которые могут вызвать мутации со сдвигом фрейма и преждевременные стоп-кодоны10.

Кинезин-7 CENP-E необходим для прикрепления кинетохорных микротрубочек и выравнивания хромосом во время деления клеток 17,18,19. Микроинъекция антител 20,21, истощение миРНК22,23, химическое ингибирование 24,25,26 и генетическая делеция 27,28,29 CENP-E приводит к рассогласованию хромосом, активации контрольной точки сборки веретена и митотическим дефектам, что приводит к анеуплоидии и хромосомной нестабильности 19,30. У мышей делеция CENP-E приводит к аномальному развитию и эмбриональной летальности на самых ранних стадиях развития 27,29,31. Генетическая делеция CENP-E обычно приводит к рассогласованию хромосом и гибели клеток 26,27,29, что является препятствием в изучении функций и механизмов белков CENP-E.

В недавнем исследовании была создана условная клеточная линия с нокаутом CENP-E с использованием ауксин-индуцируемого метода редактирования генов CRISPR/Cas932, который обеспечивает быструю деградацию белков CENP-E за относительно короткое время33. Однако на сегодняшний день стабильные клеточные линии с нокаутом CENP-E не установлены, что является нерешенной технической проблемой в биологии CENP-E. Принимая во внимание генетическую устойчивость34, генетические компенсационные реакции 35,36,37 и сложную внутриклеточную среду, поскольку прямые последствия полной делеции CENP-E могут быть сложными и непредсказуемыми, важно установить нокаутные клеточные линии CENP-E для исследования механизмов выравнивания хромосом, контрольной точки сборки веретена и нисходящих сигнальных путей.

Открытие и применение ингибиторов CENP-E имеет важное значение для лечения рака. К настоящему времени обнаружено и синтезировано семь типов ингибиторов CENP-E, в том числе GSK923295 и его производные24,25, PF-277138,39, производные имидазо[1,2-a]пиридинового каркаса40,41, соединение-А42,43, синтелин44,45, UA6278446 и производные бензо[d]пирроло[2,1-b]тиазола47. Среди этих ингибиторов GSK923295 аллостерический и эффективный ингибитор CENP-E, который связывается с моторным доменом CENP-E и ингибирует активность АТФазы, стимулированной микротрубочками CENP-E, сKi 3,2 ± 0,2 нМ 24,25. Однако, по сравнению с ингибирующим действием GSK923295 на культивируемые раковые клетки, терапевтические эффекты GSK923295 у пациентов с клиническим раком не идеальны48,49, что также вызвало опасения по поводу специфичности GSK923295 для CENP-E. Кроме того, специфичность и побочные эффекты других ингибиторов CENP-E на белки CENP-E являются ключевыми вопросами в исследованиях рака.

В этом исследовании мы полностью нокаутировали ген CENP-E в клетках HeLa с помощью системы CRISPR/Cas9. Для повышения эффективности скрининга и успешности редактирования гена CENP-E были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга, основанные на фенотипах, включая скрининг клеточных колоний, фенотипы выравнивания хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP-E. Кроме того, нокаутные клеточные линии CENP-E могут быть использованы для тестирования специфичности соединений-кандидатов на CENP-E.

Protocol

1. Построение векторов нокаута гена CRISPR/Cas9 Выберите целевую последовательность геномной ДНК на гене CENP-E человека (GenBank Accession No. NM_001286734.2) и спроектировать sgRNA с помощью онлайн-инструмента проектирования CRISPR (http://crispor.tefor.net/). Введите одну геномную последовательност?…

Representative Results

Клетки CENP-E-/- HeLa были успешно получены с помощью системы CRISPR/Cas9 (рис. 1). Временная шкала и критические экспериментальные этапы этого метода показаны на рисунке 1. Сначала мы спроектировали и синтезировали CENP-E-специфичные sgRNA, отожгли и лигир…

Discussion

Кинезин-7 CENP-E является ключевым регулятором выравнивания хромосом и контрольной точки сборки веретена во время деления клеток 17,19,20. Генетическая делеция CENP-E обычно приводит к активации контрольной точки сборки веретена, остановке кл?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим всех сотрудников Лаборатории цитоскелета Фуцзяньского медицинского университета за полезные обсуждения. Мы благодарим Цзюнь-Цзинь Линь, Чжи-Хун Хуана, Лин Линь, Ли-Ли Панга, Линь-Ин Чжоу, Си Линя и Мин-Ся Ву из Центра обслуживания государственных технологий Медицинского университета Фуцзянь за их техническую помощь. Мы благодарим Си-И Чжэна, Ин Линя и Ци Кэ из Экспериментального учебного центра фундаментальных медицинских наук Фуцзяньского медицинского университета за их поддержку. Данное исследование было поддержано следующими грантами: Национальный фонд естественных наук Китая (гранты No 82001608 и 82101678), Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (номер гранта 2019J05071), Объединенные фонды инноваций в области науки и технологий, провинция Фуцзянь, Китай (номер гранта 2021Y9160) и Фуцзяньский медицинский университет (грант No XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell’s functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Keywords: CENP-ECRISPR/Cas9KnockoutHeLa CellsChromosome AlignmentMitotic DefectsCell Cycle ArrestCell DeathKinetochore-microtubule CaptureSpindle Assembly Checkpoint
check_url/65476?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image