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Biology

Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

Abstract

Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die präzise und effiziente Genbearbeitung in einer Vielzahl von Organismen entwickelt. Das Zentromer-assoziierte Protein-E (CENP-E) ist ein Plus-End-gerichtetes Kinesin, das für die Kinetochor-Mikrotubuli-Erfassung, die Chromosomenausrichtung und den Kontrollpunkt der Spindelassemblierung benötigt wird. Obwohl die zellulären Funktionen der CENP-E-Proteine gut untersucht wurden, war es schwierig, die direkten Funktionen von CENP-E-Proteinen mit herkömmlichen Protokollen zu untersuchen, da die CENP-E-Ablation in der Regel zur Aktivierung des Checkpoints der Spindelassemblierung, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod führt. In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in humanen HeLa-Zellen vollständig ausgeschaltet und die CENP-E-/- HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System erfolgreich erzeugt.

Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Chromosomenausrichtungsphänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate der CENP-E-Knockout-Zellen effektiv verbessern. Wichtig ist, dass die CENP-E-Deletion zu einer Chromosomenfehlstellung, der abnormalen Position der BUB1-mitotischen Checkpoint-Serin/Threonin-Kinase-B-Proteine (BubR1) und mitotischen Defekten führt. Darüber hinaus haben wir das CENP-E-Knockout-HeLa-Zellmodell verwendet, um eine Identifizierungsmethode für CENP-E-spezifische Inhibitoren zu entwickeln.

In dieser Studie wurde ein nützlicher Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität von CENP-E-Inhibitoren etabliert. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die Protokolle der CENP-E-Geneditierung mit dem CRISPR/Cas9-System vorgestellt, das ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von CENP-E bei der Zellteilung sein könnte. Darüber hinaus würde die CENP-E-Knockout-Zelllinie zur Entdeckung und Validierung von CENP-E-Inhibitoren beitragen, die wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von Antitumormedikamenten, die Untersuchung von Zellteilungsmechanismen in der Zellbiologie und klinische Anwendungen haben.

Introduction

Engineered Genome Editing vermittelt die gezielte Modifikation von Genen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen. In Eukaryoten kann die ortsspezifische Mutagenese durch die Anwendung sequenzspezifischer Nukleasen eingeführt werden, die die homologe Rekombination der Ziel-DNAstimulieren 1. In den letzten Jahren wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs)2,3, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs)4,5 und Homing-Meganukleasen 6,7, entwickelt, um Genome an bestimmten Stellen zu spalten, aber diese Ansätze erfordern komplexes Protein-Engineering und redundante experimentelle Verfahren. Studien haben gezeigt, dass das prokaryotische CRISPR/Cas-System (CRISPR)/Cas-System (Typ II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) eine effiziente Gen-Editing-Technologie ist, die spezifisch die RNA-gesteuerte, ortsspezifische DNA-Spaltung in einer Vielzahl von Zellen und Spezies vermittelt 8,9,10,11. Die CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Technologie hat die Bereiche Grundlagenbiologie, Biotechnologie und Medizin revolutioniert12.

Bakterien und die meisten Archaeen haben ein RNA-basiertes adaptives Immunsystem entwickelt, das CRISPR- und Cas-Proteine verwendet, um Viren und Plasmide zu identifizieren und zu zerstören13. Streptococcus pyogenes Die Cas9 (SpCas9)-Endonuklease enthält die RuvC-ähnliche Holliday-Junction-Resolvase (RuvC) und die His-Asn-His (HNH)-Domäne, die sequenzspezifische, doppelsträngige Brüche (DSBs) effizient vermitteln kann, indem sie eine synthetische Single-Guide-RNA (sgRNA) bereitstellt, die CRISPR-RNAs (crRNA) und transaktivierende crRNA (tracrRNA) enthält14,15,16. DSBs können über den Indel-bildenden nicht-homologen Endverknüpfungsweg (NHEJ) oder den homologiegesteuerten Reparaturweg (HDR) repariert werden, der mehrere Mutationen, einschließlich Insertionen, Deletionen oder narbenlose Einzelnukleotidsubstitutionen, in Säugetierzellen einführt 1,8. Sowohl der fehleranfällige NHEJ- als auch der High-Fidelity-HDR-Signalweg können verwendet werden, um Gen-Knockout durch Insertionen oder Deletionen zu vermitteln, was zu Frameshift-Mutationen und vorzeitigen Stoppcodons führen kann10.

Kinesin-7 CENP-E wird für die Kinetochor-Mikrotubuli-Bindung und die Chromosomenausrichtung während der Zellteilung benötigt 17,18,19. Antikörper-Mikroinjektion 20,21, siRNA-Depletion22,23, chemische Hemmung 24,25,26 und genetische Deletion 27,28,29 von CENP-E führt zu einer Chromosomenfehlstellung, der Aktivierung des Spindelanordnungs-Checkpoints und mitotischen Defekten, was zu Aneuploidie und chromosomaler Instabilität führt 19,30. Bei Mäusen führt die CENP-E-Deletion zu einer abnormalen Entwicklung und embryonalen Letalität in den sehr frühen Entwicklungsstadien 27,29,31. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zu einer Chromosomenfehlstellung und zum Zelltod 26,27,29, was ein Hindernis für die Untersuchung der Funktionen und Mechanismen der CENP-E-Proteine darstellt.

Eine kürzlich durchgeführte Studie hat eine bedingte CENP-E-Knockout-Zelllinie unter Verwendung einer Auxin-induzierbaren CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Methode32 etabliert, die einen schnellen Abbau von CENP-E-Proteinen in relativ kurzer Zeit ermöglicht33. Bisher wurden jedoch keine stabilen CENP-E-Knockout-Zelllinien etabliert, was eine ungelöste technische Herausforderung in der CENP-E-Biologie darstellt. Unter Berücksichtigung der genetischen Robustheit34, der genetischen Kompensationsreaktionen 35,36,37 und der komplexen intrazellulären Umgebungen, da die direkten Folgen einer vollständigen Deletion von CENP-E komplex und unvorhersehbar sein können, ist es wichtig, CENP-E-Knockout-Zelllinien für die Untersuchung von Mechanismen der Chromosomenausrichtung, des Spindelassemblierungs-Checkpoints und der nachgeschalteten Signalwege zu etablieren.

Die Entdeckung und Anwendung von CENP-E-Inhibitoren ist wichtig für die Krebsbehandlung. Bisher wurden sieben Arten von CENP-E-Inhibitoren gefunden und synthetisiert, darunter GSK923295 und seine Derivate24,25, PF-277138,39, Imidazo[1,2-a]pyridin-Gerüstderivate40,41, Compound-A42,43, Syntelin44,45, UA6278446 und Benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazol-Derivate47. Unter diesen Inhibitoren ist GSK923295 ein allosterischer und effizienter CENP-E-Inhibitor, der an die motorische Domäne von CENP-E bindet und die CENP-E-Mikrotubuli-stimulierte ATPase-Aktivität mit einem Ki von 3,2 ± 0,2 nMhemmt 24,25. Im Vergleich zu den hemmenden Wirkungen von GSK923295 auf kultivierte Krebszellen sind die therapeutischen Wirkungen von GSK923295 bei klinischen Krebspatienten jedoch nicht ideal48,49, was auch Bedenken hinsichtlich der Spezifität der GSK923295 für CENP-E aufkommen ließ. Darüber hinaus sind die Spezifität und die Nebenwirkungen anderer CENP-E-Inhibitoren auf die CENP-E-Proteine zentrale Themen in der Krebsforschung.

In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System vollständig ausgeschaltet. Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Phänotypen der Chromosomenausrichtung und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, um die Screening-Effizienz und Erfolgsrate der CENP-E-Geneditierung zu verbessern. Darüber hinaus können CENP-E-Knockout-Zelllinien verwendet werden, um die Spezifität von Kandidatenverbindungen für CENP-E zu testen.

Protocol

1. Aufbau der CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Vektoren Wählen Sie die genomische Ziel-DNA-Sequenz auf dem humanen CENP-E-Gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) und entwerfen Sie die sgRNA mit einem Online-CRISPR-Design-Tool (http://crispor.tefor.net/). Geben Sie eine einzelne genomische Sequenz ein, wählen Sie das Genom von “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148” und wählen Sie das Protospacer-benachba…

Representative Results

Die CENP-E-/- HeLa-Zellen wurden erfolgreich mit dem CRISPR/Cas9-System erzeugt (Abbildung 1). Der Zeitplan und die kritischen experimentellen Schritte dieser Methode sind in Abbildung 1 dargestellt. Zuerst haben wir die CENP-E-spezifischen sgRNAs entworfen und synthetisiert, die sgRNAs in das pX458-Plasmid getempert und ligiert, das Plasmid in HeLa-Zellen transfiziert und sie 48 h lang kultiviert. Die transfizierten Zellen wurden di…

Discussion

Kinesin-7 CENP-E ist ein wichtiger Regulator bei der Chromosomenausrichtung und dem Kontrollpunkt der Spindelassemblierung während der Zellteilung 17,19,20. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zur Aktivierung des Spindelmontage-Checkpoints, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod 27,29,51,52.<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitgliedern des Zytoskelett-Labors der Fujian Medical University für hilfreiche Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin und Min-Xia Wu vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für ihre technische Unterstützung. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin und Qi Ke vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608 und 82101678), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (Fördernummer 2019J05071), die Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, die Provinz Fujian, China (Fördernummer 2021Y9160) und das Fujian Medical University High-Level Talents Scientific Research Start-up Funding Project (Fördernummer XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
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References

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
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