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Biology

CRISPR/Cas9システムを用いたセントロメア関連プロテイン-E CENP-E-/-ノックアウト細胞株の作製

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

本稿では、CRISPR/Cas9システムと3つの表現型ベースのスクリーニング戦略を用いたセントロメア関連プロテインE(CENP-E)ノックアウト細胞の構築について報告します。私たちは、 CENP-Eノックアウト細胞株を利用して、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための新しいアプローチを確立し、医薬品開発や生物学研究に有用です。

Abstract

CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9システムは、さまざまな生物において正確かつ効率的な遺伝子編集のための強力なツールとして登場しました。セントロメア関連プロテインE(CENP-E)は、動原体微小管の捕捉、染色体アライメント、および紡錘体アセンブリチェックポイントに必要なプラス末端指向性キネシンです。CENP-Eタンパク質の細胞機能は十分に研究されていますが、CENP-Eアブレーションは通常、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、細胞周期の停止、および細胞死につながるため、従来のプロトコルを使用してCENP-Eタンパク質の直接的な機能を研究することは困難でした。本研究では、ヒトHeLa細胞の CENP-E 遺伝子を完全にノックアウトし、CRISPR/Cas9システムを用いて CENP-E-/- HeLa細胞を作製することに成功しました。

細胞コロニースクリーニング、染色体アライメント表現型、CENP-Eタンパク質の蛍光強度など、3つの最適化された表現型ベースのスクリーニング戦略が確立され、 CENP-E ノックアウト細胞のスクリーニング効率と実験成功率を効果的に向上させました。重要なことに、 CENP-Eの 欠失は、染色体のミスアライメント、BUB1有糸分裂チェックポイントセリン/スレオニンキナーゼB(BubR1)タンパク質の異常な位置、および有糸分裂欠損をもたらします。さらに、 CENP-E ノックアウトHeLa細胞モデルを用いて、CENP-E特異的阻害剤の同定法を開発しました。

この研究では、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための有用なアプローチが確立されました。さらに、この論文では、細胞分裂におけるCENP-Eのメカニズムを調査するための強力なツールとなる可能性のあるCRISPR/Cas9システムを使用した CENP-E 遺伝子編集のプロトコルを提示します。さらに、 CENP-Eノックアウト細胞株は、抗腫瘍薬の開発、細胞生物学における細胞分裂メカニズムの研究、および臨床応用に重要な意味を持つCENP-E阻害剤の発見と検証に貢献します。

Introduction

遺伝子操作によるゲノム編集は、さまざまな細胞や生物の遺伝子の標的修飾を媒介します。真核生物では、標的DNAの相同組換えを刺激する配列特異的ヌクレアーゼの応用により、部位特異的な突然変異誘発を導入することができます1。近年、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)2,3、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)4,5、ホーミングメガヌクレアーゼ6,7など、いくつかのゲノム編集技術が特定の部位でゲノムを切断するように設計されていますが、これらのアプローチには複雑なタンパク質工学と冗長な実験手順が必要です。研究によると、II型原核生物クラスター化規則的インタースペース短回文反復(CRISPR)/Casシステムは、さまざまな細胞および種8,9,10,11においてRNA誘導部位特異的DNA切断を特異的に媒介する効率的な遺伝子編集技術であることが示されています8,9,10,11。CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウト技術は、基礎生物学、バイオテクノロジー、医学の分野に革命をもたらしました12。

バクテリアとほとんどの古細菌は、CRISPRとCasタンパク質を使用してウイルスとプラスミドを識別して破壊するRNAベースの適応免疫システムを進化させました13。化膿連鎖球菌Cas9(SpCas9)エンドヌクレアーゼには、RuvC様Holliday junction resolvase(RuvC)およびHis-Asn-His(HNH)ドメインが含まれており、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む合成シングルガイドRNA(sgRNA)を提供することにより、配列特異的な二本鎖切断(DSB)を効率的に媒介することができます14,15,16。.DSBは、哺乳類細胞に挿入、欠失、または瘢痕のない一塩基置換を含む複数の変異を導入するインデル形成非相同末端結合(NHEJ)または相同性指向性修復(HDR)経路を介して修復することができます1,8。エラーが発生しやすいNHEJ経路と忠実度の高いHDR経路の両方を使用して、挿入または欠失を介して遺伝子ノックアウトを媒介することができ、フレームシフト変異および早期停止コドンを引き起こす可能性がある10。

キネシン-7 CENP-Eは、細胞分裂中の動原体-微小管の付着と染色体アライメントに必要です17,18,19。CENP-Eの抗体マイクロインジェクション20,21、siRNA枯渇22,23、化学的阻害24,25,26、および遺伝子欠失27,28,29は、染色体のミスアライメント、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、および有糸分裂欠損を引き起こし、異数性および染色体不安定性をもたらす19,30.マウスでは、CENP-Eの欠失により、発生のごく初期段階で異常な発育と胚致死が生じます27,29,31。CENP-Eの遺伝子欠失は、通常、染色体のミスアライメントと細胞死26,27,29を引き起こし、CENP-Eタンパク質の機能とメカニズムを研究する上で障害となる。

最近の研究では、オーキシン誘導性CRISPR/Cas9遺伝子編集法32を用いて、比較的短時間でCENP-Eタンパク質の迅速な分解を可能にする条件付きCENP-Eノックアウト細胞株が確立されました33。しかし、今日まで、安定したCENP-Eノックアウト細胞株は確立されておらず、これはCENP-E生物学における未解決の技術的課題です。遺伝的頑健性34、遺伝的代償応答35、36、37、および複雑な細胞内環境を考慮すると、CENP-Eの完全な欠失の直接的な結果は複雑で予測不可能である可能性があるため、染色体アライメント、紡錘体アセンブリチェックポイント、および下流シグナル伝達経路のメカニズムを調査するためにCENP-Eノックアウト細胞株を確立することが重要です。

CENP-E阻害剤の発見と応用は、がん治療にとって重要です。現在までに、GSK923295とその誘導体24,25、PF-277138,39、イミダゾ[1,2-a]ピリジン足場誘導体40,41、化合物-A42,43、シンテリン44,45、UA6278446、ベンゾ[d]ピロロ[2,1-b]チアゾール誘導体47を含む7種類のCENP-E阻害剤が発見され、合成されている.これらの阻害剤の中で、GSK923295は、CENP−Eの運動ドメインに結合し、3.2±0.2nMのKiを有するCENP−E微小管刺激ATPアーゼ活性を阻害するアロステリックで効率的なCENP−E阻害剤である24,25。しかし、培養がん細胞に対するGSK923295の阻害効果と比較すると、臨床がん患者におけるGSK923295の治療効果は理想的ではなく48,49、CENP-EのGSK923295の特異性についても懸念が生じました。さらに、CENP-Eタンパク質に対する他のCENP-E阻害剤の特異性と副作用は、がん研究における重要な問題です。

本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いてHeLa細胞の CENP-E 遺伝子を完全にノックアウトしました。CENP-E遺伝子編集のスクリーニング効率と成功率を向上させるために、細胞コロニースクリーニング、染色体アライメント表現型、CENP-Eタンパク質の蛍光強度など、3つの最適化された表現型ベースのスクリーニング戦略が確立されています。さらに、 CENP-E ノックアウト細胞株を使用して、CENP-Eの候補化合物の特異性を試験することができます。

Protocol

1. CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトベクターの構築 ヒト CENP-E 遺伝子上の標的ゲノムDNA配列を選択します(GenBank Accession No.NM_001286734.2)を作成し、オンラインCRISPRデザインツール(http://crispor.tefor.net/)を使用してsgRNAを設計します。 ゲノム配列を1つ入力し、”Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148″のゲノムを選択し、プロ?…

Representative Results

CENP-E-/- HeLa細胞は、CRISPR/Cas9システムを用いて作製に成功しました(図1)。この分析法のタイムラインと重要な実験ステップを図 1 に示します。まず、CENP-E特異的sgRNAを設計・合成し、sgRNAをアニーリングしてpX458プラスミドにライゲーションし、プラスミドをHeLa細胞にトランスフェクションし、48時間培養しました。トランスフ?…

Discussion

キネシン-7 CENP-Eは、細胞分裂中の染色体アライメントと紡錘体アセンブリチェックポイントにおける重要な調節因子です17,19,20。CENP-Eの遺伝子欠失は、通常、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、細胞周期停止、および細胞死をもたらします27,29,51,52<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

有益な議論をしてくれた福建医科大学細胞骨格研究所のすべてのメンバーに感謝します。福建医科大学公共技術サービスセンターのJun-Jin Lin氏、Zhi-Hong Huang氏、Ling Lin氏、Li-Li Pang氏、Lin-Ying Zhou氏、Xi Lin氏、Min-Xia Wu氏の技術支援に感謝します。福建医科大学基礎医学実験教育センターのSi-Yi Zheng氏、Ying Lin氏、Qi Ke氏のご支援に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(助成金番号82001608および82101678)、中国福建省自然科学基金会(助成金番号2019J05071)、中国福建省科学技術イノベーション共同基金(助成金番号2021Y9160)、福建医科大学ハイレベル人材科学研究立ち上げ資金プロジェクト(助成金番号XRCZX2017025)の支援を受けて行われました。

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
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References

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
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