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Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Abstract

O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.

Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.

Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.

Introduction

A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo1. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)4,5 e meganucleaseshoming6,7, foram projetadas para clivar genomas em locais específicos, mas essas abordagens requerem engenharia proteica complexa e procedimentos experimentais redundantes. Estudos têm demonstrado que o sistema CRISPR/Cas (CRISPR) é uma eficiente tecnologia de edição gênica, que medeia especificamente a clivagem de DNA sítio-específica guiada por RNA em uma ampla variedade de células e espécies8,9,10,11. A tecnologia de nocaute genético CRISPR/Cas9 revolucionou os campos da biologia básica, biotecnologia e medicina12.

As bactérias e a maioria das arqueias desenvolveram um sistema imune adaptativo baseado em RNA que usa as proteínas CRISPR e Cas para identificar e destruir vírus e plasmídeos13. Streptococcus pyogenes A endonuclease Cas9 (SpCas9) contém a resolvease da junção de Holliday semelhante a RuvC (RuvC) e o domínio His-Asn-His (HNH), que pode mediar eficientemente quebras de fita dupla (DSBs) específicas de sequência, fornecendo um RNA guia único sintético (sgRNA) contendo RNAs CRISPR (crRNA) e crRNA transativador (tracrRNA)14,15,16. Os DSBs podem ser reparados através da via de junção final não homóloga (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR), que introduz múltiplas mutações, incluindo inserções, deleções ou substituições de nucleotídeos únicos sem cicatriz, em células de mamíferos 1,8. Tanto o NHEJ propenso a erros quanto a via HDR de alta fidelidade podem ser usados para mediar o knockout gênico por meio de inserções ou deleções, o que pode causar mutações frameshift e códons de parada prematura10.

A cinesina-7 CENP-E é necessária para a fixação do cinetocore-microtúbulo e alinhamento cromossômico durante a divisão celular 17,18,19. A microinjeção de anticorpos20,21, a depleção de siRNA22,23, a inibição química 24,25,26 e a deleção genética 27,28,29 do CENP-E levam ao desalinhamento cromossômico, à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso e a defeitos mitóticos, o que resulta em aneuploidias e instabilidade cromossômica19,30. Em camundongos, a deleção CENP-E resulta em desenvolvimento anormal e letalidade embrionária nos estágios mais precoces do desenvolvimento 27,29,31. A deleção genética do CENP-E geralmente leva ao desalinhamento cromossômico e morte celular 26,27,29, o que é um obstáculo no estudo das funções e mecanismos das proteínas do CENP-E.

Um estudo recente estabeleceu uma linhagem celular knockout condicional CENP-E usando um método de edição genética CRISPR/Cas9 induzível por auxina-32, que permite a rápida degradação das proteínas CENP-E em um tempo relativamente curto33. No entanto, até o momento, linhagens celulares knockout estáveis do CENP-E não foram estabelecidas, o que é um desafio técnico não resolvido na biologia do CENP-E. Considerando a robustez genética34, as respostas de compensação genética 35,36,37 e ambientes intracelulares complexos, uma vez que as consequências diretas da deleção completa do CENP-E podem ser complexas e imprevisíveis, é importante estabelecer linhagens celulares knockout do CENP-E para a investigação de mecanismos de alinhamento cromossômico, ponto de verificação de montagem do fuso e vias de sinalização a jusante.

A descoberta e a aplicação dos inibidores do CENP-E são importantes para o tratamento do câncer. Até o momento, sete tipos de inibidores do CENP-E foram encontrados e sintetizados, incluindo GSK923295 e seus derivados24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]piridínico40,41, composto A42,43, sintalina44,45, UA6278446 e derivados benzo[d]pirrolo[2,1-b]tiazol47. Dentre esses inibidores, o GSK923295 é um inibidor alostérico e eficiente do CENP-E que se liga ao domínio motor do CENP-E e inibe a atividade da ATPase estimulada por microtúbulos do CENP-E com Ki de 3,2 ± 0,2 nM24,25. No entanto, comparados com os efeitos inibitórios da GSK923295 em células cancerosas cultivadas, os efeitos terapêuticos da GSK923295 em pacientes clínicos com câncernão são ideais48,49, o que também levantou preocupações sobre a especificidade da GSK923295 para o CENP-E. Além disso, a especificidade e os efeitos colaterais de outros inibidores do CENP-E sobre as proteínas do CENP-E são questões fundamentais na pesquisa do câncer.

Neste estudo, nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9. Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, para melhorar a eficiência de triagem e a taxa de sucesso da edição do gene CENP-E. Além disso, linhagens celulares knockout do CENP-E podem ser usadas para testar a especificidade de compostos candidatos para o CENP-E.

Protocol

1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9 Selecione a sequência de DNA genômico alvo no gene CENP-E humano (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e projetar o sgRNA usando uma ferramenta de projeto CRISPR on-line (http://crispor.tefor.net/). Insira uma única sequência genômica, selecione o genoma de “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análise hg38) + polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): dbSNP148”, e selecione o motivo adjacente…

Representative Results

As células CENP-E-/- HeLa foram geradas com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). A linha do tempo e as etapas experimentais críticas desse método são mostradas na Figura 1. Primeiro, projetamos e sintetizamos os sgRNAs específicos do CENP-E, recoteamos e ligamos os sgRNAs no plasmídeo pX458, transfectamos o plasmídeo em células HeLa e os cultivamos por 48 h. As células transfectadas foram dissociadas e semead…

Discussion

A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52.<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University por sua assistência técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke do Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seu apoio. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608 e 82101678), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bolsa 2019J05071), os Fundos Conjuntos para a Inovação da Ciência e Tecnologia, a Província de Fujian, China (número de bolsa 2021Y9160) e o projeto de financiamento de iniciação científica de talentos de alto nível da Universidade de Medicina de Fujian (número de bolsa XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
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References

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
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