Summary
En analytisk arbeidsflyt basert på væskekromatografi, mobilitetsspektrometri for fangede ioner og time-of-flight massespektrometri (LC-TIMS-ToF MS/MS) for høy konfidensialitet og svært reproduserbar "bottom-up"-analyse av histonmodifikasjoner og identifikasjon basert på hovedparametere (retensjonstid [RT], kollisjonstverrsnitt [CCS] og nøyaktig masse-til-ladning [m/z]-forhold).
Abstract
Histonproteiner er svært rikelig og konservert blant eukaryoter og spiller en stor rolle i genregulering som følge av strukturer kjent som posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM). Identifisering av posisjonen og naturen til hver PTM eller mønster av PTM i referanse til eksterne eller genetiske faktorer gjør at denne informasjonen kan statistisk korreleres med biologiske responser som DNA-transkripsjon, replikasjon eller reparasjon. I det foreliggende arbeidet beskrives en analytisk protokoll med høy gjennomstrømning for deteksjon av histon PTM fra biologiske prøver. Bruken av komplementær væskekromatografi, mobilitetsspektrometri for fangede ioner og massespektrometri (LC-TIMS-ToF MS/MS) muliggjør separasjon og PTM-tildeling av de mest biologisk relevante modifikasjonene i en enkelt analyse. Den beskrevne tilnærmingen utnytter den siste utviklingen i avhengig datainnsamling (DDA) ved bruk av parallell akkumulering i mobilitetsfellen, etterfulgt av sekvensiell fragmentering og kollisjonsindusert dissosiasjon. Histon-PTM-er tildeles trygt basert på deres oppbevaringstid, mobilitet og fragmenteringsmønster.
Introduction
I eukaryote celler pakkes DNA som kromatin i funksjonelle enheter kalt nukleosomer. Disse enhetene består av en oktamer med fire kjernehistoner (to hver av H2A, H2B, H3 og H4)1,2,3,4. Histoner er blant de mest tallrike og svært konserverte proteinene i eukaryoter, som i stor grad er ansvarlige for genregulering5. Histon posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) spiller en stor rolle i reguleringen av kromatindynamikk og rigger ulike biologiske prosesser som DNA-transkripsjon, replikasjon og reparasjon6. PTM forekommer primært på den tilgjengelige overflaten av de N-terminale områdene av histoner som er i kontakt med DNA 3,7. Imidlertid påvirker hale- og kjernemodifikasjoner kromatinstrukturen, endrer internukleosominteraksjoner og rekrutterer spesifikke proteiner 3,8.
En aktuell utfordring under væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS)-basert proteomikk er potensiell co-eluering av analytter av interesse. Når det gjelder dataavhengige analyser (DDA), betyr dette potensielt tap av flere forløperioner under MS/MS-innsamlingsprosessen9. ToF-instrumenter (time-of-flight) oppnår spektra med svært høy frekvens 9,10 (opptil titalls kHz)11; Dette gjør dem i stand til raskt å skanne de totale forløperionene i en kompleks prøve (MS1), og dermed love optimal følsomhet og MS / MS-sekvenseringshastigheter (opptil 100 Hz) 9 og gjør dem ideelle for biologisk prøveanalyse10. Likevel er følsomheten som er tilgjengelig ved disse høye skannehastighetene begrenset av MS / MS-hastigheten9. Tilsetningen av fanget ionmobilitetsspektrometri (TIMS) i kombinasjon med et ortogonalt kvadrupol time-of-flight (qToF) massespektrometer ble brukt til å redusere disse begrensningene. I TIMS akkumuleres alle forløperioner i tandem og elueres som en funksjon av deres mobilitet, i stedet for å velge enkeltforløpermasser med en kvadrupol9. Parallell akkumulering-seriell fragmentering (PASEF) tillater hundrevis av MS/MS-hendelser per sekund uten tap av følsomhet9.
Hovedmålet med dette arbeidet var å vise den siste utviklingen av DDA ved hjelp av parallell akkumulering i mobilitetsfellen etterfulgt av sekvensiell fragmentering og kollisjonsindusert dissosiasjon (CID). Histon-PTM-er ble trygt tildelt basert på deres oppbevaringstider (RT), mobiliteter og fragmenteringsmønstre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Histonprøver ble ekstrahert ved hjelp av en metode tilpasset fra Bhanu et al. (2020) 12.
1. Forberedelse av prøver
- Høsting av dyrkede celler
- Når cellene er 80 % sammenflytende, må du sørge for at de er levedyktige ved hjelp av trypanblå ekskludering.
MERK: En HeLa S3-cellelinje ble brukt til disse eksperimentene, men denne metoden kan brukes på alle dyrkede celler. - Aspirer mediet, og påfør deretter 5 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) på hver plate.
- Roter platen(e) for å skylle alle gjenværende medier, aspirer deretter PBS og påfør 5 ml 1x PBS.
- Separer cellene forsiktig fra platen ved å skrape dem med en engangs celleløfter.
- Overfør hver cellesuspensjon til et 15 ml konisk rør.
- Pellet cellene ved å sentrifugere ved 800 x g i 5 minutter.
- Aspirer PBS fra cellepelleten.
- Fortsett til histonutvinning.
MERK: Flashfrys cellepelleten i flytende nitrogen hvis den ikke kan behandles umiddelbart. Oppbevar pelletsene ved -80 °C til de er klare.
- Når cellene er 80 % sammenflytende, må du sørge for at de er levedyktige ved hjelp av trypanblå ekskludering.
- Histon-ekstraksjon
- Beregn volumet av hver cellepellet og merk menisken med en permanent markør.
- Forbered nok kjernefysisk isolasjonsbuffer (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 og 250 mM sukrose) for alle prøvene. Alternativt, hvis mange prøver må behandles over tid, lag bufferen i bulk og lagre ved 2-8 °C i opptil 6 måneder, eller alikot og frys ved -15 °C til -25 °C på ubestemt tid ved å tine bare den mengden som er nødvendig for hver ekstraksjon.
MERK: Bufferen skal være klar under lagring. Hvis bufferen får et uklart eller på annen måte unormalt utseende når som helst, kast og tilbered ny buffer. - Forbered 50 ganger volumet av cellepellets av vaskebuffer og tilsett hemmere som følger (ca. 10 ml vaskebuffer per 2 prøver).
- For å forberede 10 ml vaskebuffer, bland 10 ml NIB, 30 μL 200 mM 4- (2-aminoetyl)benzensulfonylfluoridhydroklorid [AEBSF], 10 μL 1 M dithiothreitol [DTT], 20 μL 5 μM microcystin, 20 μL 5 M natriumbutyrat.
- Fjern 1/5 av vaskebufferen for å klargjøre lysisbufferen (1/5 volum fra vaskebuffer, 0,3 % NP-40 eller NP-40-alternativ).
MERK: Ikke bruk Triton-X 100 i stedet for NP-40 eller NP-40 alternativ, da det kan være for slipende for visse celletyper. - Vask cellepelleten grundig ved å oppbevare den i 5 kolonner vaskebuffer og sentrifugere ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fullfør dette trinnet to ganger, aspirer og kast supernatanten mellom vask.
- Forsikre deg om at volumet av cellepelleten fortsatt er merket med en permanent markør. Resuspender i 10 volumer lysisbuffer.
- Pipette-bland hver pellet grundig for å resuspendere, og rug deretter i 15 minutter på is.
- Etter 15 min, sentrifuger ved 800 x g i 5 min ved 4 °C.
- Aspirer og kast supernatanten.
MERK: Pelleten skal redusere til ≤ 1/2 den opprinnelige pelletsstørrelsen (som indikert av markørlinjen). Hvis pelleten ikke har redusert tilstrekkelig, gjenta lysisprosedyren og inkluder et forsiktig homogeniseringstrinn ved hjelp av en pistill for å bryte opp cellene. - Når lyseringen er fullført, resuspenderes pelleten i 500 μL vaskebuffer, deretter sentrifuge ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer og kast supernatanten, og gjenta deretter vasketrinnet en gang til for å fjerne alle spor av NP-40.
MERK: På dette tidspunktet består pelleten av kromatin, som inneholder histoner. - Resuspender pelleten i 5 volumer (av den opprinnelige cellepelletsstørrelsen) på 0,4NH2SO4.
- Inkuber i 2 timer i et kaldt rom eller kjøleskap ved hjelp av en omrører.
- Etter 2 timer, sentrifuger prøven(e) ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Ikke kast supernatanten.
- Overfør supernatanten til nye rør, og øk 100 % trikloreddiksyre (TCA) til 1/3 av innholdsvolumet (endelig TCA-konsentrasjon vil være ca. 20 %).
- Snu tuben forsiktig og observer at den klare, fargeløse oppløsningen blir hvit og/eller uklar, noe som indikerer proteinutfelling.
MERK: For løsninger med lave histonkonsentrasjoner kan proteinutfellingen ikke være umiddelbart merkbar, men bunnfallet skal være synlig etter inkubasjonen over natten. - Inkuber uten forstyrrelser over natten (12-18 timer) ved 4 °C for å felle ut histonproteinene fullstendig.
- Neste dag, sentrifuger ved 3400 x g i 5 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, pass på at du ikke berører sidene av røret med pipettespissen. På dette stadiet blir histonene avsatt primært som en film rundt sidene av røret (e).
- Tilsett 500 μL iskald aceton + 0,1% HCl (syreaceton) til hvert rør, bruk en glass Pasteur-pipette, og snu deretter røret (e) flere ganger. Ordne prøvene i rekkefølge (1, 2, 3, etc.) mens du gjør dette, da enhver feilaktig aceton kan fjerne merkene på rørene. Sentrifuger ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C og dekanter supernatanten forsiktig.
- Gjenta dette skylletrinnet med 500 μL iskald 100% aceton, også med en glass Pasteur-pipette. Sentrifuger ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C og dekanter supernatanten forsiktig.
- La rørene tørke ved romtemperatur til gjenværende aceton har fordampet.
- Når det er tørt, tilsett 100 μL massespektrometri (MS) -grade vann til hvert rør. Bruk denne dråpen til å tørke alle sider av beholderen for å resuspendere hele histonfilmen. Gjør dette ved å pipetere dråpen på siden av røret og rotere den mens du pipetterer opp og ned eller dispenserer halvparten av 100 μL og bruker spissen til å røre den rundt. En kombinasjon av begge metodene fungerer best. Histoner er lett løselige i vann og vil være i løsningen.
- Etter resuspendering av alle prøver, hvis det er noe gjenværende hvitt faststoff, sonikere i et bad ved romtemperatur i 5 minutter.
- Sentrifuge ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør den klare oppløsningen til friske rør. Kast gjenværende uoppløselig pellet.
- Kjør en SDS-PAGE under reduserende forhold for å bekrefte at uttrekket er rent.
MERK: Geler kan kjøres med en hvilken som helst passende konsentrasjon av polyakrylamid så lenge det kan skille proteiner i området 10-20 kDa. Se materialfortegnelsen for gelene som brukes i denne protokollen. - Utfør en proteinkonsentrasjonsanalyse (dvs. Bradford eller BCA) for å bestemme den totale proteinkonsentrasjonen.
- Kjemisk derivatisering (propionylering) av lysinrester
- Overfør 20 μg histoner (bestemt av proteinanalysen) til et rent rør. Tørk denne prøven ned til <5 μL ved hjelp av en vakuumkonsentrator, og resuspender deretter med 20 μL 100 mM ammoniumbikarbonat (NH4CO3) (~ 1 μg / μL løsning). Juster pH til ~8 ved hjelp av ammoniumhydroksid om nødvendig.
FORSIKTIG: Ikke bruk ammoniumhydroksid (NH4OH) til å resuspendere, bare til å justere pH om nødvendig. Ellers vil proteiner denaturere og utfelle.
MERK: For å kontrollere pH med minimalt prøvetap, bruk en pipettespiss til å dyppe i prøven og dab på en pH-stripe. Denne testprosedyren vil være nyttig gjennom de gjenværende prøveprepareringstrinnene. - Forbered propionyleringsreagenset ved å tilsette propionsyreanhydrid til acetonitril (ACN) i forholdet 1: 3 (v / v) (dvs. for å lage 40 μL reagens, kombiner 10 μL propionsyreanhydrid med 30 μL ACN).
MERK: Tradisjonelt har metanol eller isopropanol blitt brukt til fremstilling av et propionyleringsreagens. Siden propionylering er en amiddannelsesreaksjon, er det nødvendig med et ikke-protonisk løsningsmiddel, som acetonitril, for å forhindre uønskede bivirkninger og reaksjoner, slik som metylpropionylester, som skyldes bruk av metanol. Forbered bare nok propionyleringsreagens for opptil 4 prøver om gangen, slik at reagenset forblir friskt. Bruk reagenset innen 1-2 min etter preparatet. Når reagenset sitter, vil propionsyreanhydridet reagere med hvilken som helst omgivende fuktighet, og eddiksyre vil begynne å danne, noe som kan endre effektiviteten til reagenset og vil endre pH i histonoppløsningen når reagenset er tilsatt. - Tilsett propionyleringsreagens til hver prøve i en 1: 4 (v / v) (dvs. for 20 μL histoner, tilsett 5 μL propionyleringsreagens).
- Tilsett raskt 1:5 (v/v)NH4OH (dvs. tilsett 4 μL for 20 μL av histonoppløsningen) for å gjenopprette oppløsningens pH til ~8. Hvis pH fortsatt er for lav, tilsett 1-2 μL NH4OH om gangen til en pH på 8 oppnås. Vanligvis er et forhold på 1:5 (v/v) tilstrekkelig.
- Inkuber prøvene ved romtemperatur i 15 minutter uten forstyrrelser.
- Gjenta propionyleringsreaksjonen for ikke mer enn 3-4 prøver per batch propionyleringsreagens for å sikre minimal syredannelse.
- Gjenta propionyleringsprosedyren trinn 1.3.2-1.3.5. En andre runde med propionylering sikrer at >95% av tilgjengelige lysiner er derivatisert.
- Tørk prøvene ned til <5 μL ved hjelp av en vakuumkonsentrator. Dette vil fordampe ethvert uomsatt propionyleringsreagens, syreprodukter og ammoniakkgass frigjort fra NH4OH. Hvis prøvene tørker helt ut, er dette greit, da det ikke oppstår noe betydelig prøvetap.
MERK: Fordyp luft i propionsyreanhydridflasken med argongass før lagring for å forhindre dannelse av eddiksyre på grunn av kontakt med omgivelsesfuktighet som er igjen i flasken.
- Overfør 20 μg histoner (bestemt av proteinanalysen) til et rent rør. Tørk denne prøven ned til <5 μL ved hjelp av en vakuumkonsentrator, og resuspender deretter med 20 μL 100 mM ammoniumbikarbonat (NH4CO3) (~ 1 μg / μL løsning). Juster pH til ~8 ved hjelp av ammoniumhydroksid om nødvendig.
- Proteolytisk fordøyelse med trypsin
- Resuspender histoner i 100 mM NH4HCO3 for å oppnå et volum på 20 μL, og oppnå en optimal konsentrasjon på 1 μg / μL.
MERK: Prøveløsninger med konsentrasjoner lavere enn 1 μg / μL vil resultere i redusert trypsineffektivitet. - Legg trypsin til histonprøver i forholdet 1:10 (vekt/vekt) (dvs. tilsett 2 μL 1 μg / μL-oppløsning av trypsin til 20 μg histoner).
- Inkuber reaksjoner ved 37 °C i 6-8 timer. Alternativt kan du ruge over natten (12-18 timer) ved romtemperatur.
- Stopp fordøyelsen ved å fryse ved -80 °C i minst 1 time.
MERK: Ikke bruk syre for å slukke fordøyelsesreaksjonen, da dette vil føre til et uønsket fall i pH på dette punktet i prosedyren. Prøven kan oppbevares ved -80 °C til den er klar til å fortsette (midlertidig stopppunkt).
- Resuspender histoner i 100 mM NH4HCO3 for å oppnå et volum på 20 μL, og oppnå en optimal konsentrasjon på 1 μg / μL.
- Kjemisk derivatisering (propionylering) av peptid N-terminaler
- Tørk prøvene til <5 μL ved hjelp av en vakuumkonsentrator.
- Resuspender prøvene opp til 20 μL (1 μg/μL) ved bruk av 100 mM NH4HCO3.
- Gjenta propionyleringen som før (trinn 1.3).
MERK: Det er normalt at prøvene tar lengre tid å tørke på dette trinnet på grunn av et høyere vandig: organisk faseforhold.
- Eksempel på avsalting med scenespisser
- Resuspender eller fortynn prøver med 50 μL MS-vann + 0,1% TFA.
- Bruk en 11-G prøvekorer til å stanse ut 5 disker med C18-materiale fra en fastfaseekstraksjonsskive (stans ut alle 5 diskene før overføring til pipettespissen). Sett inn og sørg for at skivene er forsvarlig og jevnt kilt i bunnen av en 200 μL pipettespiss (figur 1).
MERK: Bruk 15-G corer hvis du avsalter over 25 μg prøve gjennom en enkelt trinnspiss. - Bruk en sentrifugeadapter til å holde trinnspissene på plass i mikrosentrifugerør på 1,5 ml eller 2 ml.
MERK: For de følgende sentrifugeringstrinnene, bruk langsom (400-500 x g) omdreining ved 4 ° C, i 1-2 minutter om gangen; Løsningsmidlene passerer normalt gjennom harpiksen på mindre enn 1 min, avhengig av hvor tett C18-materialet er pakket inn i spissene. - Skyll harpiksen ved å sentrifugere med 50 μL 100% acetonitril for å aktivere C18-materialet og fjerne potensielle forurensninger.
MERK: Det kan være lettere å laste løsninger på scenespissene ved hjelp av gellastende pipettespisser. Når C18-materialet er aktivert, er det viktig å ikke la harpiksen tørke ut i løpet av avsaltingsprosedyren. - Balansere diskmaterialet med 80 μL MS-vann + 0,1% TFA ved sentrifugering.
- Forsur prøven til pH 4 eller lavere ved bruk av iseddik. Kontroller pH med pH-striper som før for å minimere prøvetap.
- Legg hele prøven på harpiksskiven ved langsom sentrifugering.
- Vask prøven med 80 μL MS-vann + 0,1% TFA ved sentrifugering.
- Eler prøven til et rent 1,5 ml rør ved å skylle 70 μL 75 % acetonitril og 0,5 % eddiksyre ved langsom sentrifugering. Ytterligere sentrifugeringstid kan brukes til å sikre at hele prøvevolumet elueres fra trinnspissen. Det er greit hvis harpiksen tørker ut med den ekstra sentrifugeringstiden, da den ikke lenger er nødvendig forbi elueringen av prøven.
- Tørk hver prøve helt i en vakuumkonsentrator.
MERK: Prøve(r) kan oppbevares ved -80 °C til den er klar til å fortsette (midlertidig stopppunkt). - For LC-MS/MS-analyse, rekonstituer prøvene i et volum løsningsmiddel A (0,1 % maursyre) fra LC-protokollen (væskekromatografi) som gir den endelige konsentrasjonen på 0,4 μg/μL (dvs. oppløs 20 μg histoner i 50 μL oppløsningsmiddel A).
2. TIMS programvare grensesnitt
- Velg kategorien Instrument og bytt til Operate (kontroller at instrumentnavnet blir uthevet i grønt) (figur 2).
- Verifiser TIMS-parametere (figur 2).
- Kontroller MS-innstillingene (skannestart, skanneslutt, ionpolaritet, skannemodus) (figur 2).
- Kontroller TIMS-innstillingene (modus, mobilitetsstart, mobilitetsslutt, rampetid, akkumuleringstid, driftssyklus, rampehastighet, MS-hastighet, MS-gjennomsnitt og autokalibrering) (figur 2).
- Gå til kategorien Kilde og aktiver sprøytealternativet (Hamilton 500 μL) bare for TuneMix-kalibreringstrinnet (figur 3)13.
- Gå til Kalibreringsfanen , klikk m / z, velg Kalibreringsmodus, og velg modus (Forbedret Q, generelt), zoom (+0.01%) STD Dev (0.24), og klikk Kalibrer; Når en score på 100 % er oppnådd, aksepter (figur 4).
- Gå til mobilitetsfanen og gjenta kalibreringsprosessen (lineær modus, generelt), deteksjonsområde (+5%), bredde (0,1 Da), STD Dev (0,1855), og klikk deretter kalibrer; når du får en score ≥ 98,5%, godta (figur 5).
- Gå til metoden og velg metoden som skal brukes; for dette eksemplet ble Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl valgt (figur 5).
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS / MS
- Bruk de typiske nESI-driftsforholdene: 4500 V kapillærspenning, 800 V endeplateforskyvning, 3,0 bar forstøvertrykk, 10,0 l/min tørrgass, 200 °C tørrvarmer og 50 μL/min injeksjonsstrømningshastighet.
- Bruk de typiske MS-innstillingene: 6 eV kollisjonsenergi, 1200 Vpp kollisjon RF, 75 μs overføringstid, 5 μs prepulslagring.
- Bestem drivgasstrømmen ved hjelp av trykkforskjellen fra inngangstrakten P1 og utgangstrakten P2. Parallell akkumulering-seriell fragmentering (PASEF) forekommer i TIMS-cellen, og akkumulerer alle forløperioner samtidig i stedet for individuelt. Forløperioner frigjøres deretter i smale ionetopper mot de normalt mye bredere toppene (ca. 50 ganger kortere), noe som øker signal-støy-forholdet mens det fortsatt separerer co-eluerende peptider via mobilitet14.
- Utvikle en LC-TIMS-ToF MS/MS-metode for analyse av proteolytiske histonpeptider. Koble en høytytende væskekromatograf (HPLC) utstyrt med en C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) kolonne med et kommersielt TIMS-TOF MS-instrument med proprietær PASEF-teknologi.
MERK: Denne kolonnestørrelsen ble bestemt til å gi god separasjon ved både høy og lav pH for peptidblandinger, basert på tidligere publiserte arbeider 15,16,17.- Sett injeksjonsvolumet til 20 μL (8 μg) prøvetaking og en strømningshastighet på 0,4 ml/min.
- Kjør en 60-min, ikke-lineær LC-gradient ved bruk av vann med 0,1% maursyre (løsningsmiddel A) og acetonitril med 0,1% maursyre (løsningsmiddel B). Still inn gradienten: 10 % B i 2,7 min, deretter til 20 % B på 5,3 minutter, 28 % B på 4 minutter, 35 % B i ytterligere 18 minutter, til 40 % B på 13 minutter og 100 % B i ytterligere 2 minutter. Etter å ha holdt 100% B i 5 min, senk konsentrasjonen til 10% B på 5 minutter og hold i de siste 5 min.
- Verifiser prøveeluering fra HPLC til TIMS-TOF via nano-elektrosprayionisering (nESI) i positiv ioniseringsmodus.
4. Dataanalyse
- Identifiser peptidsekvensene og modifikasjonsstedene.
- Utarbeide en teoretisk liste over peptider ved hjelp av ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] under MS-digest-verktøyet.
- Utfør en teoretisk fordøyelse mens du tar hensyn til betingelsene for fordøyelsen (enzymet som brukes), typer PTM som søkes etter (f.eks. mono-, di- eller trimetylering), størrelsesområdet for peptider som søkes etter, samt massedeteksjonsområde og potensielt antall ubesvarte spaltninger.
- Utarbeide en teoretisk liste over peptider ved hjelp av ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] under MS-digest-verktøyet.
- Analyser de oppkjøpte dataene manuelt basert på teoretiske peptider (figur 6)12.
- Søk etter massene ved flere ladningstilstander (+1 til +4) for hvert teoretisk peptid søkes etter.
- Etter den første identifiseringen av hver m / z, velg toppen og bekreft MS / MS ved hjelp av en teoretisk liste over fragmenteringsioner basert på peptidsekvensen, inkludert PTM.
MERK: Hvis mobiliteten til det identifiserte peptidet var kjent tidligere, er dette også bekreftet.
- Beregn de relative mengdene til forskjellige PTM og rapporter hver modifikasjon som en prosentandel av den angitte peptidsekvensen.
- Den relative overflod av hver oppdaget PTM beregnes ved hjelp av følgende ligning:
Relativ mengde = Areal av PTM / Totalt areal av umodifiserte og PTM for et gitt peptid
- Den relative overflod av hver oppdaget PTM beregnes ved hjelp av følgende ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En bottom-up proteomisk arbeidsflyt (figur 7) innebærer vanligvis følgende: ekstraksjon av målproteinet (e) fra en råprøve, etterfulgt av kvantifisering av konsentrasjonen av proteinet (e), og deretter fraksjonering, vanligvis ved gelelektroforese eller væskekromatografi. Etter fraksjonering fordøyes proteinene ved hjelp av et proteolytisk enzym (ofte trypsin), og til slutt massespektrometrisk analyse av de resulterende peptidene og proteinidentifikasjon ved hjelp av en etablert database18. Sekvensinformasjon er avledet fra forløperioner innenfor det angitte masse-til-ladning (m / z) -området, som blir utsatt for kollisjonsindusert dissosiasjon (CID), og produserer fragmenteringsmønstre som skal identifiseres og sekvenseres ved hjelp av en database19 (figur 8).
For dette arbeidet var hovedmålet å utvikle og anvende en LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA-metode ved å følge trinnene beskrevet tidligere i protokolldelen. Bestemmelse av posisjonaliteten til posttranslasjonelle modifikasjoner på isomere og isobariske peptider har gitt en spesiell utfordring med hensyn til identifikasjon og spektrumtolkning. I denne studien ble rekombinante humane histonstandarder og HeLa S3-celler brukt som prøver.
Histon PTM-analyse av humane histonstandarder via ESI-TIMS-PASEF-ToF MS / MS ga mellomstore til store peptider (3-30 aminosyrer i lengde) detektert med så mange som 5 ladninger per peptid. Propionyleringsprosedyren var vellykket i å produsere lengre, mer informative peptider enn de som vanligvis produseres av tryptisk fordøyelse. Ved dataanalyse ble peptider identifisert i forskjellige modifiserte tilstander. Som en fordel differensierte den TIMS-baserte metoden noen posisjonelle isomere peptider som bærer de samme PTM-ene. For eksempel kan to isomere arter overlappe hverandre i retensjonstid og m/z; De to signalene kunne imidlertid skilles fra hverandre i mobilitetsdomenet (figur 9).
De tilsvarende fragmenteringsspektrene for peptidene vist i figur 9 ble kommentert av proteomisk analyseprogramvare ved hjelp av de aktuelle FASTA-filene. I figur 9A ses det umodifiserte peptidet med tre propionylgrupper (+56,03) (på N-terminal, lysin 18 og lysin 23). I figur 9B observeres peptidet med en acetylgruppe (+42,02) på lysin 18 og to propionylgrupper (en ved N-terminalen og en på lysin 23). Til slutt, i figur 9C ses peptidet med en acetylering observert på lysin 23 og to propionylgrupper (på N-terminal og lysin 18). Som publisert tidligere, kan PASEF-fordelen brukes til å øke sekvenseringshastigheten og følsomheten ved å målrette den samme funksjonen gjentatte ganger9. Dette gjør det mulig for brukeren å få mer strukturell informasjon fra biologiske prøver. I dette tilfellet brukes dette på typen og posisjonen til PTM-er som forekommer på hver histon.
Posttranslasjonell modifikasjonsanalyse kan også representeres visuelt som et sekvensdekningsplott, som vist i figur 10. I figur 10A presenterer histon H3-standarden som har blitt propionylert før fordøyelsen, lengre peptider enn ellers ville ha resultert, betegnet med de blå linjene. Histoner ekstrahert fra HeLa S3-celler ble behandlet på samme måte, som representert ved figur 10B. Flere PTM ble indikert, inkludert mange forskjellige mønstre i de samme aminosyreposisjonene. Dette er å forvente fra biologiske prøver. Merk at de få grå linjene i figur 10B angir peptider som ble identifisert tvetydig på grunn av mangel på MS2 som følge av lav intensitet.
Figur 1: Skjematisk fremstilling og produksjon av scenetips. (A-G) Trinn-for-trinn-veiledning for fremstilling av en C18-silikaskive trinnspiss. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Databehandling: 20210804 propionylerte standard histoner Mix_QC peptid. Før du begynner å behandle dataene, må du sørge for å utarbeide den teoretiske listen over mulige ladningstilstander og deres fragmenteringer (1550.9013; 775.9543; 517.6386; etc.) for å trekke ut disse verdiene fra basetoppkromatogrammet (BPC + All MS). Etter å ha trukket ut hvert peptid, sørg for at det ser ut som analyselisten vist på figuren. Toppen 775.9543 ble valgt som eksempel. På høyre side av figuren vises tre grafer: den første tilsvarer kromatogrammet (intensitet vs. tidsgraf), den andre til mobilogrammet og den tredje til massespekteret med PASEF-fragmentering inkludert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: timsControl-protokollen trinn 1-4. Figuren viser de fire første trinnene i timsControl-prosedyren. Klikk på Instrument-knappen øverst til venstre for å slå av og på tilkoblingen mellom instrumentet og programvaren. Før du utfører en oppgave, må man sørge for at programvaren er i driftsmodus. Til slutt må du kontrollere at TIMS-parametrene er riktige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kildeparametere. I dette tilfellet ble sprøyte Hamilton 500 μL bare brukt til TuneMix. Kontroller at de andre parameterne forblir riktige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kalibrering av masse-til-ladning (m/z). Velg Kalibrer til du har fått en poengsum på 100 % i Kalibreringsmodus nederst til venstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kalibrering av mobilitet. Velg Kalibrer til en poengsum på minst 98,5 % er oppnådd i Kalibreringsmodus nederst til venstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Typisk arbeidsflyt for proteomikk nedenfra og opp. Trinn for trinn i bottom-up-prosedyrene fra prøvepreparering til identifisering9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Retensjonstid, isotopisk mønster og H3 18-26 mobilitetsprofiler. (A) Umodifisert propionylert, (B) K23Ac peptid propionylert i de to andre posisjonene, og (C) K18Ac propionylert i de to andre posisjonene. Legg merke til fordelene ved mobilitetsseparasjonen for tilfellet av strukturisomerer vist i panelene B og C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Eksempel på MS/MS-fragmentering av peptidsekvensering med PASEF. Fragmentspektra ble oppnådd fra proteomisk analyseprogramvare for H3-peptidet med aminosyreposisjoner 18-26. (A) umodifisert propionylert, (B) K23Ac peptid propionylert i de to andre posisjonene, og (C) K18Ac propionylert i de to andre posisjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Eksempel på et visuelt histon PTM-analysesammendrag. Resultater av observerte peptider og PTM fra (A) en H3-standard og (B) H3 fra HeLa S3-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Standard og HeLa S3 peptid LC-TIMS-ToF MS / MS egenskaper. Liste over mål og observerte peptider, inkludert eksperimentelle egenskaper (dvs. retensjonstid, m/z, 1/Ko og LC-toppområder). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histoner er grunnleggende proteiner som regulerer kromatinstrukturen ved å interagere med DNA i form av oktamere som består av de fire kjernehistonene (to hver av H2A, H2B, H3 og H4)20. Histoner inneholder mange lysin- og argininrester, som lett modifiseres, noe som fører til omfattende PTM som endrer kromatinkjemien ved å påvirke histonfunksjonen eller ved binding til andre cellulære proteiner21. PTM kan fremkalle biologiske responser ved å jobbe sammen, med spesifikke grupper av PTM som har blitt rapportert i flere sykdommer, spesielt flere typer kreft22.
Når DNA-skade gjenkjennes på mobilnivå, følges det umiddelbart av virkningen av en kompleks signalkaskade hvor lesjoner er merket, etterfulgt av koordinering av cellesyklusprogresjon og aktivering av de nødvendige reparasjonsveiene. I tillegg induserer DNA-skade forskjellige modifikasjoner, for eksempel acetyl- og metyladdukter, noe som letter proteinrekruttering23. Det store utvalget av PTM som er involvert i DNA-lesjoner fører til spørsmålet om hvordan disse molekylære mekanismene regulerer deres sameksistens og hva den funksjonelle betydningen av å forsvare genomets integritet gjennom et ekstremt komplekst integrert nettverk er. For eksempel har lysin 9 trimetylering av histon H3 (H3K9me3) vært knyttet til forskjellige patologier i ulike sykdommer24. Av grunner som dette er det nødvendig å utvikle instrumentelle analytiske metoder som tillater fullstendig karakterisering av disse modifikasjonene på mobilnivå23.
Analyse av HeLa S3 histonekstraksjoner ved hjelp av manuell dataanalyseprogramvare og proteomisk analyseprogramvare avslørte PTM, inkludert acetylering (+42,01 Da), metylpropionylering (+70,04 Da), dimetylering (+28,03 Da) og trimetylering (+42,05) for flere histonproteiner. I tillegg var den PASEF-baserte MS / MS-metoden i stand til å skille noen posisjonelle isomere peptider som bærer de samme PTM-ene.
I introduksjonen beskrives kort fordelene ved å koble LC-TIMS-ToF MS/MS i studien av PTM for å vise den siste utviklingen av DDA ved bruk av parallell akkumulering i mobilitetsfellen etterfulgt av sekvensiell fragmentering og kollisjonsindusert dissosiasjon. Hovedideen er å etablere en metodikk som muliggjør oppløsning av signaler som kommer fra forskjellige peptider, og som frem til nå ikke har vært i stand til å løse. Derivatiseringsprosessen ved bruk av propionanhydrid forhindrer spaltning av lysin C-terminaler av trypsin, og genererer lengre, mer informative peptider. Peptider med samme m/z og retensjonstid kunne identifiseres ved deres fragmenteringsmønstre, men det ble også sett at noen av disse artene kunne separeres i mobilitetsdomenet ved hjelp av denne LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS-metoden.
For bedre å forstå dette representerer figur 8 tre hovedegenskaper for ethvert molekyl, og tillater dermed identifisering av en forbindelse, enten de er intakte proteiner, lipider eller peptider (i dette tilfellet histon H3 18-26), for å nevne noen eksempler. Disse egenskapene inkluderer retensjonstiden (min) av en forbindelse i kromatografisk kolonne, masseladningsforholdet (m / z) for hver forbindelse og mobiliteten (1 / Ko) som disse forbindelsene presenterer når de interagerer med drivgassen. I figur 8A er det umodifiserte H3-peptidet 18-26 vist å ha en RT på 28,15 min og at det presenterer to bånd i mobilitetsspekteret, noe som indikerer at det har minst to konformasjoner, et resultat som mistenkes å være et resultat av de to lysinene (18 og 23) som har blitt propionylert etter den tidligere beskrevne protokollen. Følgende spektra (figur 8B,C) viser samme peptid (H3 18-26), men varierer posisjonen til acetyleringsgruppen (42,02) mellom B, K18Ac og C, K23Ac. Disse to isomerene (K18Ac og K23Ac) har blitt identifisert gjennom mobilogrammet, da de presenterer forskjellige romlige fordelinger, noe som resulterer i forskjellige interaksjoner med gassen i TIMS-cellen. Betydningen av denne metoden ligger i muligheten for å identifisere og studere mer detaljert de forskjellige PTM-ene som har vært assosiert med forskjellige sykdommer gjennom for eksempel DNA-skade.
Når fragmenteringsdata er sparsomme, er det utfordrende å identifisere en modifikasjon ved en bestemt rest fordi to eller flere forskjellige modifikasjoner kan forekomme samtidig ved (eller nær) de samme restene og kan forstås som en enkelt modifikasjon25. Dette kan løses ved å sikre at det umodifiserte peptidet er identifisert, spesielt ved å bruke en standard for å bekrefte eller nekte tilstedeværelsen av en enkelt modifikasjon i stedet for flere modifikasjoner (tabell 1).
For å unngå overdreven forurensning eller ekstraksjoner av urene histoner, er det viktig å kontrollere kvaliteten på reagensene før bruk. For eksempel, hvis NIB-bufferløsningen lagres og brukes i bulk, må du sørge for at løsningen er klar uten ytre turbiditet eller unormal presentasjon. Turbiditet kan være et resultat av bakterievekst, noe som vil forurense prøver og kan resultere i en blanding av histoner og bakterielle proteiner. I tillegg anbefales det å forberede ferske kalibreringskurver for analyser, for eksempel BCA- eller Bradford-analysen som brukes til å bestemme proteinkonsentrasjonen, slik at proteinet som brukes til kalibreringskurven ikke utløper eller nedbrytes.
Denne metoden kan utvides til andre typer celler eller organismer, for eksempel mygg. Når det gjelder hele eller delvise organismer, er det spesielt viktig å velge et passende antall organismer for å sikre at den endelige histonkonsentrasjonen er egnet for analyse.
Også, som en generell retningslinje for massespektrometervedlikehold, bør frontenden rengjøres med jevne mellomrom for å forhindre oppbygging på instrumentet og forurensning mellom løpene. Denne rengjøringen bør inkludere gardin, åpningsplate og kvadrupol, etter behov.
Generelt, når en LC brukes, er det nødvendig å ta hensyn til å forberede ferske mobile faser hver uke ved hjelp av MS-grade løsningsmidler. Det er god praksis å ha dedikerte pipetter og glass for mobil faseklargjøring og å rense LC-linjene når nye løsninger plasseres på systemet. Beskyttelses- og separasjonskolonner bør vanligvis byttes ut hver 100-200 injeksjoner og 500-1500 injeksjoner, henholdsvis26. Sørg for å injisere emner før og etter å ha kjørt en gruppe prøver. Hvis det er et stort antall prøver innenfor en gitt batch, kan man også vurdere å kjøre et tomt med forskjellige intervaller i batchen.
Protokollen gir en PASEF-basert DDA-arbeidsflyt for påvisning av histon PTM og differensiering av isobariske og isomere arter basert på ionmobilitet.
Denne protokollen krever omfattende prøvepreparering, og total forberedelsestid for eksperimentelle prøver bør tas hensyn til. I gjennomsnitt krever prøveprepareringsprotokollen 2-3 virkedager å fullføre. I tillegg kan forskjeller mellom laboratorier og instrumentversjoner påvirke analysens generelle sensitivitet.
Svært få proteomiske dataanalyseprogrammer har blitt ansett som tilstrekkelige for bruk til å analysere histoner via bottom-up-metoder uten manuell justering eller korreksjon 27,28,29. Resultatene bør (i det minste i begynnelsen) bekreftes ved hjelp av manuell analyse, som også er tidkrevende. Hvis analytisk programvare brukes, bør den ha MS/MS-merknadsfunksjoner, som vanligvis er enkle å bekrefte eller avvise.
Det er også verdt å nevne at det er umulig å skille isomerer gjennom massespektrometri med mindre en TIMS-celle settes inn og mobilitetsverdier brukes; For eksempel kan posisjonene til histonmodifikasjoner bestemmes ved hjelp av fragmenteringsmønstre (PASEF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Melvin A. Park og Matthew Willetts er ansatte i Bruker Daltonics Inc., produsenten av timsTOF-instrumentet.
Acknowledgments
Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under Grant No. HRD-1547798 og tilskudd nr. HRD-2111661. Disse NSF-tilskuddene ble tildelt Florida International University som en del av Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST) -programmet. Dette er bidragsnummer 1672 fra Institute of Environment, et fremtredende program ved Florida International University. Ytterligere støtte ble gitt av National Institute of Health under tilskudd nr. R21AI135469 til Francisco Fernandez-Lima og Grant nr. R01HD106051 til Benjamin A. Garcia, samt av National Science Foundation under Grant nr. CHE-2127882 til Benjamin A. Garcia. Forfatterne ønsker å anerkjenne den første støtten fra Dr. Mario Gomez Hernandez under innledende metodeutvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
