Microscopie à deux photons sensible à la polarisation pour une caractérisation de la structure amyloïde sans marquage

Summary

Cet article décrit comment la microscopie à deux photons sensible à la polarisation pourrait être appliquée pour caractériser l’organisation locale au sein de superstructures-sphérolites amyloïdes sans marquage. Il décrit également comment préparer et mesurer l’échantillon, assembler la configuration requise et analyser les données pour obtenir des informations sur l’organisation locale des fibrilles amyloïdes.

Abstract

Par rapport à son homologue à un photon, l’excitation à deux photons est bénéfique pour les expériences de bio-imagerie en raison de sa phototoxicité plus faible, de sa pénétration tissulaire plus profonde, de son fonctionnement efficace dans les systèmes densément emballés et de la photosélection angulaire réduite des fluorophores. Ainsi, l’introduction de l’analyse de polarisation en microscopie à fluorescence à deux photons (2PFM) permet une détermination plus précise de l’organisation moléculaire d’un échantillon par rapport aux méthodes d’imagerie standard basées sur des processus optiques linéaires. Dans ce travail, nous nous concentrons sur la 2PFM sensible à la polarisation (ps-2PFM) et son application dans la détermination de l’ordre moléculaire au sein de bio-structures complexes-sphérolites amyloïdes. Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson sont souvent diagnostiquées par la détection d’agrégats amyloïdes-protéines formés en raison d’un processus de mauvais repliement des protéines. L’exploration de leur structure permet de mieux comprendre leur parcours de création et, par conséquent, de développer des méthodes de diagnostic plus sensibles. Cet article présente le ps-2PFM adapté à la détermination de l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des sphérulites d’insuline bovine et des agrégats de protéines amyloïdogènes sphériques. De plus, nous démontrons que la technique proposée permet de résoudre l’organisation tridimensionnelle des fibrilles à l’intérieur de la spherulite.

Introduction

Au cours des dernières décennies, bien qu’il y ait eu un développement significatif de nombreuses techniques de microscopie à fluorescence pour la bio-imagerie des protéines et de leurs agrégats¹, seules quelques-unes ont été utilisées pour résoudre leur ordre local au sein de l’échantillon ^2,3. La microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence⁴ a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité structurale intrinsèque des superstructures-sphérolites amyloïdes. De plus, la détermination quantitative de l’ordre local à l’intérieur de biostructures complexes et densément emballées telles que les sphérulites pourrait être résolue à l’aide de méthodes sensibles à la polarisation³. Cependant, les techniques de fluorescence standard avec pénétration superficielle des tissus sont limitées car l’utilisation de longueurs d’onde UV-VIS pour exciter les fluorophores in vivo conduit à une diffusion élevée de la lumière tissulaire⁵. De plus, une telle imagerie nécessite souvent de concevoir et de lier des sondes fluorescentes spécifiques à une biomolécule ciblée, ce qui augmente le coût et la quantité de travail nécessaire pour effectuer l’imagerie.

Récemment, pour résoudre ces problèmes, notre équipe a adapté la microscopie à fluorescence excitée à deux photons sensible à la polarisation (ps-2PFM) pour l’imagerie sans marquage des structures biologiques ^6,7. Ps-2PFM permet de mesurer la dépendance de l’intensité de la fluorescence à deux photons sur la direction de polarisation linéaire du faisceau d’excitation et d’analyser la polarisation de la fluorescence émise⁸. La mise en œuvre de cette technique nécessite de compléter le chemin d’excitation standard du microscope multiphotonique (Figure 1) par une plaque demi-onde pour contrôler le plan de polarisation de la lumière. Ensuite, des graphiques polaires, illustrant la dépendance de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons sur la polarisation du faisceau laser d’excitation, sont créés à partir de signaux collectés par deux photodiodes à avalanche, rassemblant ainsi les deux composantes mutuellement perpendiculaires de la polarisation de fluorescence.

La dernière étape est le processus d’analyse des données, en tenant compte de l’impact des éléments optiques, tels que les miroirs dichroïques ou un objectif à grande ouverture numérique, sur la polarisation. En raison de la nature du processus à deux photons, cette méthode permet à la fois une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée, car l’excitation à deux photons des fluorophores en dehors du plan focal est limitée de manière probabiliste. Il a également été prouvé que des méthodes similaires pouvaient être mises en œuvre avec succès pour l’imagerie in vivo de sondes dans le proche infrarouge (NIR) pour l’imagerie des tissus profonds⁹. Le Ps-2PFM a déjà été appliqué à l’imagerie des fluorophores dans les membranes cellulaires¹⁰ et l’ADN^11,12, ainsi qu’à des marqueurs fluorescents non standard de systèmes biologiques, tels que les nanoparticules d’or¹³. Cependant, dans tous ces exemples, l’information sur l’organisation des biomolécules a été obtenue indirectement et a nécessité une orientation mutuelle prédéfinie entre un fluorophore et une biomolécule.

Dans l’un de nos articles récents, nous avons montré que le ps-2PFM pouvait être appliqué avec succès pour déterminer la polarisation locale de l’autofluorescence des superstructures amyloïdes et de la fluorescence de la thioflavine T, un colorant spécifique de l’amyloïde, lié aux fibrilles amyloïdes dans les sphérulites⁶. De plus, dans un autre cas, nous avons prouvé que le ps-2PFM pouvait être utilisé pour détecter l’orientation des fibrilles amyloïdes à l’intérieur des sphérulites amyloïdes dans un régime de taille submicronique, ce qui a été confirmé en le corrélant avec l’imagerie par microscopie électronique à transmission (MET)⁷. L’obtention de ce résultat a été possible grâce à i) l’autofluorescence intrinsèque des sphéroulites-amyloïdes, lorsqu’elles sont excitées avec un ou deux photons, présente une autofluorescence intrinsèque avec des maxima d’émission situés dans une gamme de 450 à 500 nm et des sections efficaces d’absorption à deux photons comparables à celles des colorants fluorescents standard¹⁴, ii) des modèles mathématiques introduits précédemment pour décrire comment le ps-2PEF des colorants marquant les membranes biologiques et les structures de l’ADN pourrait être appliqué à fluorescence manifestée par les sphérulites et les colorants qui leur sont liés ^8,11,15. Ainsi, avant de procéder à l’analyse, nous vous recommandons vivement de consulter la théorie requise décrite à la fois dans le texte principal et les informations à l’appui de notre premier article sur ce sujet⁶. Nous présentons ici le protocole d’application de la technique ps-2PFM pour une caractérisation structurale amyloïde sans marquage des sphérulites d’insuline bovine.

Protocol

1. Préparation des lames de microscope avec des sphérulites adultes REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole. Toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau déminéralisée (18,2 MΩ·cm à 25 °C) obtenue à partir du système de purification de l’eau. Incuber les sphérulites amyloïdes selon le protocole décrit par Krebs et al<su…

Representative Results

Le protocole présenté fournit des conseils étape par étape tout au long de la préparation des superstructures amyloïdes pour les tests avec ps-2PFM, la construction du système microscopique et les mesures de l’échantillon approprié. Cependant, avant la dernière série de mesures, il est essentiel d’aligner correctement les APD avec une référence isotrope, ce qui devrait permettre de collecter un signal symétrique de forme et d’intensité similaires sur les deux détecteurs (Figure …

Discussion

La microscopie à deux photons sensible à la polarisation est un outil précieux pour étudier l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des superstructures amyloïdes, ne nécessitant que de petites modifications de la configuration multiphotonique standard. Puisqu’il fonctionne sur des phénomènes optiques non linéaires, il est possible d’obtenir une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée par rapport aux méthodes de microscopie à fluorescence excitée par un photon. De …

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5