Microscopía de dos fotones sensible a la polarización para una caracterización estructural amiloide sin marcadores

Summary

Este artículo describe cómo se podría aplicar la microscopía de dos fotones sensible a la polarización para caracterizar la organización local dentro de las superestructuras de amiloide sin marcado-esferulitas. También describe cómo preparar y medir la muestra, ensamblar la configuración requerida y analizar los datos para obtener información sobre la organización local de las fibrillas amiloides.

Abstract

En comparación con su contraparte de un fotón, la excitación de dos fotones es beneficiosa para los experimentos de bioimagen debido a su menor fototoxicidad, penetración más profunda en los tejidos, operación eficiente en sistemas densamente empaquetados y fotoselección angular reducida de fluoróforos. Por lo tanto, la introducción del análisis de polarización en la microscopía de fluorescencia de dos fotones (2PFM) proporciona una determinación más precisa de la organización molecular en una muestra en comparación con los métodos de imagen estándar basados en procesos ópticos lineales. En este trabajo, nos centramos en el 2PFM sensible a la polarización (ps-2PFM) y su aplicación en la determinación del ordenamiento molecular dentro de bioestructuras complejas-esferulitas amiloides. Las enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer o el Parkinson, a menudo se diagnostican a través de la detección de agregados de proteínas amiloides formados debido a un proceso alterado de plegamiento incorrecto de proteínas. Explorar su estructura conduce a una mejor comprensión de su vía de creación y, en consecuencia, al desarrollo de métodos de diagnóstico más sensibles. En este trabajo se presenta el ps-2PFM adaptado para la determinación del ordenamiento local de las fibrillas dentro de las esferulitas de insulina bovina y agregados proteicos amiloidogénicos esféricos. Además, comprobamos que la técnica propuesta puede resolver la organización tridimensional de las fibrillas dentro de la esferulita.

Introduction

En las últimas décadas, aunque ha habido un desarrollo significativo de numerosas técnicas de microscopía de fluorescencia para la bioimagen de proteínas y sus agregados¹, solo unas pocas se han utilizado para resolver su ordenamiento local dentro de la muestra ^2,3. Se utilizó la microscopía de fluorescencia⁴ para estudiar la heterogeneidad estructural intrínseca de las superestructuras amiloides-esferulitas. Además, la determinación cuantitativa del ordenamiento local dentro de bioestructuras complejas y densamente empaquetadas, como las esferulitas, podría resolverse utilizando métodos sensibles a la polarización³. Sin embargo, las técnicas de fluorescencia estándar con penetración superficial en el tejido son limitadas, ya que el uso de longitudes de onda UV-VIS para excitar fluoróforos in vivo conduce a una alta dispersión de la luz tisular⁵. Además, este tipo de imágenes a menudo requiere el diseño y la unión de sondas fluorescentes específicas a una biomolécula específica, lo que aumenta el costo y la cantidad de trabajo necesario para realizar las imágenes.

Recientemente, para abordar estos problemas, nuestro equipo ha adaptado la microscopía de fluorescencia excitada por dos fotones sensible a la polarización (ps-2PFM) para obtener imágenes sin marcadores de estructuras biológicas ^6,7. Ps-2PFM permite medir la dependencia de la intensidad de fluorescencia de dos fotones en la dirección de polarización lineal del haz de excitación y el análisis de la polarización de la fluorescencia emitida⁸. La implementación de esta técnica requiere la suplementación de la ruta de excitación estándar de configuración de microscopio multifotónico (Figura 1) con una placa de media onda para controlar el plano de polarización de la luz. A continuación, se crean gráficos polares, que representan la dependencia de la intensidad de la fluorescencia excitada por dos fotones en la polarización del rayo láser de excitación, a partir de las señales recogidas por dos fotodiodos de avalancha, recogiendo así los dos componentes mutuamente perpendiculares de la polarización de la fluorescencia.

El último paso es el proceso de análisis de datos, teniendo en cuenta el impacto de los elementos ópticos, como espejos dicroicos o un objetivo de alta apertura numérica, sobre la polarización. Debido a la naturaleza del proceso de dos fotones, este método proporciona una fotoselección angular reducida y una resolución axial mejorada, ya que la excitación de dos fotones de los fluoróforos fuera del plano focal está probabilísticamente limitada. También se demostró que se podían implementar con éxito métodos similares para la obtención de imágenes in vivo de sondas de infrarrojo cercano (NIR) para la obtención de imágenes de tejidos profundos⁹. Ps-2PFM se ha aplicado previamente para obtener imágenes de fluoróforos en membranas celulares¹⁰ y ADN^11,12, así como marcadores fluorescentes no estándar de sistemas biológicos, como las nanopartículas de oro¹³. Sin embargo, en todos estos ejemplos, la información sobre la organización de las biomoléculas se obtenía de forma indirecta y requería una orientación mutua predefinida entre un fluoróforo y una biomolécula.

En uno de nuestros artículos recientes, hemos demostrado que ps-2PFM podría aplicarse con éxito para determinar la polarización local de la autofluorescencia de las superestructuras de amiloide y la fluorescencia de la tioflavina T, un colorante específico de amiloide, unido a las fibrillas de amiloide en las esferulitas⁶. Además, en otro, hemos demostrado que ps-2PFM podría utilizarse para detectar la orientación de las fibrillas amiloides dentro de las esferulitas amiloides en un régimen de tamaño submicrónico, lo que se confirmó al correlacionarlo con imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)⁷. El logro de este resultado fue posible gracias a i) la autofluorescencia intrínseca de esferulitas-amiloides, cuando se excitan con uno o dos fotones, exhiben autofluorescencia intrínseca con máximos de emisión ubicados en un rango de 450 a 500 nm y secciones transversales de absorción de dos fotones comparables con los colorantes fluorescentes estándar¹⁴, ii) modelos matemáticos introducidos anteriormente para describir cómo se podría aplicar el ps-2PEF de colorantes que marcan membranas biológicas y estructuras de ADN a fluorescencia exhibida por esferulitas y colorantes unidos a ellas ^8,11,15. Por lo tanto, antes de continuar con el análisis, recomendamos encarecidamente revisar la teoría requerida descrita tanto en el texto principal como en la información de apoyo de nuestro primer artículo sobre este tema⁶. Aquí, presentamos el protocolo de cómo aplicar la técnica ps-2PFM para una caracterización estructural amiloide libre de etiquetas de esferulitos de insulina bovina.

Protocol

1. Preparación de los portaobjetos del microscopio con esferulitas adultas NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo. Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada (18,2 MΩ·cm a 25 °C) obtenida del sistema de purificación de agua. Incubar las esferulitas amiloides según el protocolo descrito por Krebs et al16.</em…

Representative Results

El protocolo presentado proporciona una guía paso a paso a través de la preparación de superestructuras amiloides para pruebas con ps-2PFM, la construcción del sistema microscópico y las mediciones de la muestra adecuada. Sin embargo, antes del conjunto final de mediciones, es vital alinear correctamente los APD con una referencia isotrópica, lo que debería dar como resultado la recopilación de una señal simétrica de forma e intensidad similares en ambos detectores (Figura 4C). Inc…

Discussion

La microscopía de dos fotones sensible a la polarización es una herramienta valiosa para estudiar el orden local de las fibrillas dentro de las superestructuras amiloides, requiriendo solo pequeñas modificaciones de la configuración multifotónica estándar. Dado que opera en fenómenos ópticos no lineales, se puede lograr una fotoselección angular reducida y una resolución axial mejorada en comparación con los métodos de microscopía de fluorescencia excitada por un fotón. Además, conduce a una menor dispersi…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5