Summary

מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב לאפיון מבני עמילואיד ללא תוויות

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

מאמר זה מתאר כיצד ניתן ליישם מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב כדי לאפיין את הארגון המקומי בתוך מבני-על-עמילואיד-ספרוליטים נטולי תוויות. הוא גם מתאר כיצד להכין ולמדוד את הדגימה, להרכיב את ההתקנה הנדרשת, ולנתח את הנתונים כדי לקבל מידע על הארגון המקומי של סיבי עמילואיד.

Abstract

בהשוואה למקבילו בעל פוטון אחד, עירור של שני פוטונים מועיל לניסויי הדמיה ביולוגית בגלל רעילות האור הנמוכה שלו, חדירה עמוקה יותר של רקמות, פעולה יעילה במערכות צפופות ובחירת אור זוויתית מופחתת של פלואורופורים. לפיכך, הכנסת ניתוח קיטוב במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים (2PFM) מספקת קביעה מדויקת יותר של הארגון המולקולרי בדגימה בהשוואה לשיטות הדמיה סטנדרטיות המבוססות על תהליכים אופטיים ליניאריים. בעבודה זו אנו מתמקדים ב-2PFM (ps-2PFM) הרגיש לקיטוב ויישומו בקביעת הסדר המולקולרי בתוך ביו-מבנים מורכבים-עמילואיד ספרוליטים. מחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון מאובחנות לעתים קרובות באמצעות זיהוי של אגרגטים עמילואידים-חלבונים שנוצרו עקב תהליך קיפול שגוי של חלבון. חקירת המבנה שלהם מובילה להבנה טובה יותר של מסלול היצירה שלהם וכתוצאה מכך, לפיתוח שיטות אבחון רגישות יותר. מאמר זה מציג את ps-2PFM המותאם לקביעת סדר פיבריל מקומי בתוך ספרוליטים של אינסולין בקר וצברי חלבונים עמילואידוגניים כדוריים. יתר על כן, אנו מוכיחים כי הטכניקה המוצעת יכולה לפתור את הארגון התלת ממדי של סיבים בתוך הספרוליט.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, למרות שחלה התפתחות משמעותית של טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות רבות לדימות ביולוגי של חלבונים וצברים שלהם1, רק מעטים שימשו כדי לפתור את הסדר המקומי שלהם בתוך הדגימה 2,3. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי4 שימש לחקר ההטרוגניות המבנית הפנימית של מבני-על עמילואידים-ספרוליטים. יתר על כן, קביעה כמותית של הסדר המקומי בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים וצפופים כגון ספרוליטים יכולה להיפתר באמצעות שיטות רגישות לקיטוב3. עם זאת, טכניקות פלואורסצנטיות סטנדרטיות עם חדירה שטחית לרקמות מוגבלות מכיוון ששימוש באורכי גל UV-VIS כדי לעורר פלואורופורים in vivo מוביל לפיזור אור רקמה גבוה5. בנוסף, הדמיה כזו דורשת לעתים קרובות תכנון וקשירה של גשושיות פלואורסצנטיות ספציפיות לביומולקולה ממוקדת, ובכך מגדילה את העלות ואת כמות העבודה הדרושה לביצוע הדמיה.

לאחרונה, כדי לטפל בבעיות אלה, הצוות שלנו התאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורר שני פוטונים רגישים לקיטוב (ps-2PFM) להדמיה ללא תוויות של מבנים ביולוגיים 6,7. Ps-2PFM מאפשר למדוד את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות של שני פוטונים בכיוון הקיטוב הליניארי של קרן העירור וניתוח הקיטוב של הפלואורסצנטיות הנפלטת8. היישום של שיטה זו דורש תוספת של נתיב עירור סטנדרטי של מערך מיקרוסקופ רב-פוטונים (איור 1) עם לוח חצי גל כדי לשלוט במישור קיטוב האור. לאחר מכן, גרפים קוטביים, המתארים את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים בקיטוב של קרן לייזר העירור, נוצרים מאותות שנאספו על ידי שתי פוטודיודות מפולת שלגים, ובכך אוספים את שני המרכיבים המאונכים זה לזה של קיטוב פלואורסצנטי.

השלב האחרון הוא תהליך ניתוח הנתונים, תוך התחשבות בהשפעת האלמנטים האופטיים, כגון מראות דיכרואיות או יעד צמצם מספרי גבוה, על הקיטוב. בגלל אופיו של תהליך שני פוטונים, שיטה זו מספקת הן בחירת צילום זוויתית מופחתת והן רזולוציה צירית משופרת, שכן עירור שני פוטונים של פלואורופורים מחוץ למישור המוקד מוגבל מבחינה הסתברותית. כמו כן הוכח כי שיטות דומות יכולות להיות מיושמות בהצלחה עבור הדמיה in vivo של בדיקות אינפרא אדום קרוב (NIR) עבור דימות רקמות עמוקות9. Ps-2PFM יושם בעבר על פלואורופורים של תמונות בקרומי תאים10 ו-DNA11,12, כמו גם על סמנים פלואורסצנטיים לא סטנדרטיים של מערכות ביולוגיות, כגון ננו-חלקיקי זהב13. עם זאת, בכל הדוגמאות הללו, המידע על ארגון הביומולקולות התקבל בעקיפין ודרש אוריינטציה הדדית מוגדרת מראש בין פלואורופור לביומולקולה.

באחד המאמרים האחרונים שלנו, הראינו כי ps-2PFM יכול להיות מיושם בהצלחה לקביעת הקיטוב המקומי של אוטופלואורסצנטיות של מבני על עמילואיד ופלואורסנציה מתיופלבין T, צבע ספציפי לעמילואיד, הקשור לסיבי עמילואיד בספרוליטים6. יתר על כן, במקרה אחר, הוכחנו כי ps-2PFM יכול לשמש כדי לזהות כיוון פיבריל עמילואיד בתוך ספרוליטים עמילואיד במשטר גודל תת-מיקרון, אשר אושר על ידי קורלציה עם דימות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)7. ההישג של תוצאה זו התאפשר הודות ל-i) אוטופלואורסנציה פנימית של ספרוליטים-עמילואידים, כאשר הם מעוררים עם פוטון אחד או שניים, מציגים אוטופלואורסצנטיות פנימית עם מקסימום פליטה הממוקם בטווח שבין 450 ל-500 ננומטר ושני חתכי בליעה של שני פוטונים הדומים לצבעים פלואורסצנטיים סטנדרטיים14, ii) מודלים מתמטיים שהוצגו בעבר כדי לתאר כיצד ps-2PEF של צבעים המסמנים קרומים ביולוגיים ומבני DNA יכולים להיות מיושמים על פלואורסצנטיות המוצגת על ידי ספרוליטים וצבעים הקשורים אליהם 8,11,15. לכן, לפני שנמשיך בניתוח, אנו ממליצים בחום לעבור על התיאוריה הנדרשת המתוארת בשניהם, הטקסט העיקרי והמידע התומך של המאמר הראשון שלנו בנושאזה 6. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול כיצד ליישם את טכניקת ps-2PFM עבור אפיון מבני עמילואיד ללא תווית של ספרוליטים של אינסולין בקר.

Protocol

1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ עם ספרוליטים מגודלים במלואם הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. כל התמיסות הוכנו עם מים נטולי יונים, (18.2 MΩ·cm ב-25°C) שהתקבלו ממערכת טיהור המים. לדגור על הספרוליטים העמילו?…

Representative Results

הפרוטוקול המוצג מספק הדרכה שלב אחר שלב באמצעות הכנת מבני על עמילואידיים לבדיקה עם ps-2PFM, בניית המערכת המיקרוסקופית ומדידות של הדגימה המתאימה. אולם לפני סדרת המדידות הסופית, חיוני ליישר כראוי את ה-APDs עם ייחוס איזוטרופי, מה שאמור לגרום לאיסוף אות סימטרי בעל צורה ועוצמה דומות בשני הגלאים (<strong …

Discussion

מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב הוא כלי רב ערך לחקר הסדר המקומי של סיבים בתוך מבני העל של עמילואיד, הדורש רק שינויים קטנים של מערך המולטיפוטונים הסטנדרטי. מכיוון שהוא פועל על תופעות אופטיות לא ליניאריות, ניתן להשיג בחירת צילום זוויתית מופחתת ורזולוציה צירית משופרת בהשוואה לשיטות מיקרו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט סונטה ביס 9 (2019/34/E/ST5/00276) שמומן על ידי המרכז הלאומי למדע בפולין.

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures – local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc’h, V., Brasselet, S., Roch, J. -. F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer’s disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., Mély, Y., Duportail, G., et al. . Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. , 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Play Video

Cite This Article
Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

View Video