Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

Summary

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Abstract

Im Vergleich zu ihrem Ein-Photonen-Gegenstück ist die Zwei-Photonen-Anregung für Bioimaging-Experimente von Vorteil, da sie eine geringere Phototoxizität, ein tieferes Eindringen in das Gewebe, einen effizienten Betrieb in dicht gepackten Systemen und eine reduzierte Winkelphotoselektion von Fluorophoren bietet. Die Einführung der Polarisationsanalyse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (2PFM) ermöglicht somit eine präzisere Bestimmung der molekularen Organisation in einer Probe im Vergleich zu Standard-Bildgebungsverfahren, die auf linearen optischen Verfahren basieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf polarisationsempfindliches 2PFM (ps-2PFM) und seine Anwendung bei der Bestimmung der molekularen Ordnung in komplexen Biostrukturen-Amyloid-Sphäroliten. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson werden häufig durch den Nachweis von Amyloid-Protein-Aggregaten diagnostiziert, die aufgrund eines gestörten Proteinfehlfaltungsprozesses gebildet werden. Die Erforschung ihrer Struktur führt zu einem besseren Verständnis ihres Entstehungsweges und folglich zur Entwicklung empfindlicherer diagnostischer Methoden. In dieser Arbeit wird das ps-2PFM vorgestellt, das für die Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten und sphärischen amyloidogenen Proteinaggregaten geeignet ist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vorgeschlagene Technik die dreidimensionale Organisation von Fibrillen im Inneren des Sphäruliths auflösen kann.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregaten^entwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen ^2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie⁴ wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisationssensitiven Methoden^{aufgelöst werden 3}. Standard-Fluoreszenztechniken mit oberflächlicher Gewebepenetration sind jedoch begrenzt, da die Verwendung von UV-VIS-Wellenlängen zur Anregung von Fluorophoren in vivo zu einer hohen Gewebelichtstreuung führt⁵. Darüber hinaus erfordert eine solche Bildgebung häufig die Entwicklung und Bindung spezifischer Fluoreszenzsonden an ein Zielbiomolekül, wodurch die Kosten und der Arbeitsaufwand für die Durchführung der Bildgebung erhöht werden.

Um diese Probleme anzugehen, hat unser Team kürzlich die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (ps-2PFM) für die markierungsfreie Abbildung biologischer Strukturen angepasst ^6,7. Ps-2PFM ermöglicht die Messung der Abhängigkeit der Zwei-Photonen-Fluoreszenzintensität von der Richtung der linearen Polarisation des Anregungsstrahls und die Analyse der Polarisation der emittierten Fluoreszenz⁸. Die Implementierung dieser Technik erfordert die Ergänzung des Standard-Multiphotonenmikroskop-Anregungspfads (Abbildung 1) um eine Halbwellenplatte zur Steuerung der Lichtpolarisationsebene. Dann werden Polargraphen, die die Abhängigkeit der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzintensität von der Polarisation des Anregungslaserstrahls darstellen, aus Signalen erstellt, die von zwei Avalanche-Photodioden gesammelt werden, und so die beiden zueinander senkrechten Komponenten der Fluoreszenzpolarisation sammeln.

Der letzte Schritt ist der Datenanalyseprozess, bei dem der Einfluss der optischen Elemente, wie z. B. dichroitische Spiegel oder ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur, auf die Polarisation berücksichtigt wird. Aufgrund der Beschaffenheit des Zwei-Photonen-Prozesses bietet diese Methode sowohl eine reduzierte Winkel-Photoselektion als auch eine verbesserte axiale Auflösung, da die Zwei-Photonen-Anregung von Fluorophoren außerhalb der Fokusebene probabilistisch begrenzt ist. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass ähnliche Methoden erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung von Nahinfrarot-Sonden (NIR) für die Tiefengewebebildgebung eingesetzt werden können⁹. Ps-2PFM wurde zuvor zur Abbildung von Fluorophoren in Zellmembranen¹⁰ und DNA^11,12 sowie von Nicht-Standard-Fluoreszenzmarkern biologischer Systeme, wie z. B. Goldnanopartikeln¹³, eingesetzt. In all diesen Beispielen wurde die Information über die Organisation von Biomolekülen jedoch indirekt gewonnen und erforderte eine vordefinierte gegenseitige Orientierung zwischen einem Fluorophor und einem Biomolekül.

In einer unserer jüngsten Arbeiten haben wir gezeigt, dass ps-2PFM erfolgreich zur Bestimmung der lokalen Polarisation der Autofluoreszenz von Amyloid-Überstrukturen und der Fluoreszenz von Thioflavin T, einem Amyloid-spezifischen Farbstoff, der an Amyloidfibrillen in Sphäroliten gebunden ist, eingesetzt werden kann⁶. Darüber hinaus haben wir in einer anderen Studie bewiesen, dass ps-2PFM verwendet werden kann, um die Orientierung von Amyloidfibrillen in Amyloid-Sphäroliten in einem Submikrometer-Größenbereich zu detektieren, was durch Korrelation mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde⁷. Das Erreichen dieses Ergebnisses war möglich dank i) der intrinsischen Autofluoreszenz von Sphärolith-Amyloiden, die mit einem oder zwei Photonen angeregt werden, eine intrinsische Autofluoreszenz mit Emissionsmaxima in einem Bereich von 450 bis 500 nm und Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitten aufweisen, die mit Standard-Fluoreszenzfarbstoffen vergleichbar sind¹⁴, ii) mathematische Modelle, die zuvor eingeführt wurden, um zu beschreiben, wie ps-2PEF von Farbstoffen, die biologische Membranen und DNA-Strukturen markieren, angewendet werden könnte Fluoreszenz von Sphäroliten und an sie gebundenen Farbstoffen ^8,11,15. Bevor wir mit der Analyse fortfahren, empfehlen wir daher dringend, die erforderliche Theorie durchzusehen, die sowohl im Haupttext als auch in den unterstützenden Informationen unseres ersten Artikels zu diesem Thema^{beschrieben ist 6}. In dieser Arbeit stellen wir das Protokoll zur Anwendung der ps-2PFM-Technik für eine markierungsfreie Amyloid-Strukturcharakterisierung von bovinen Insulinsphäroliten vor.

Protocol

1. Präparation der Objektträger mit ausgewachsenen Sphäroliten HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 °C) hergestellt, das aus dem Wasseraufbereitungssystem gewonnen wurde. Inkubieren Sie die Amyloid-Sphärulite auf der Grundlage des von Krebs et al.16….

Representative Results

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung durch die Vorbereitung von Amyloid-Suprastrukturen für Tests mit ps-2PFM, den Aufbau des mikroskopischen Systems und die Messungen der richtigen Probe. Vor den endgültigen Messungen ist es jedoch wichtig, die APDs richtig auf eine isotrope Referenz auszurichten, was dazu führen sollte, dass auf beiden Detektoren ein symmetrisches Signal ähnlicher Form und Intensität gesammelt wird (Abbildung 4C). Selbst minimale Unter…

Discussion

Die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der lokalen Anordnung von Fibrillen innerhalb der Amyloid-Überstrukturen, das nur kleine Modifikationen des Standard-Multiphotonen-Aufbaus erfordert. Da sie mit nichtlinearen optischen Phänomenen arbeitet, können im Vergleich zu Methoden der einphotonenangeregten Fluoreszenzmikroskopie eine reduzierte Winkelphotoselektion und eine verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Darüber hinaus führt es zu einer geringe…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5