Summary
ここでは、複合植物を生産するために アグロバクテリウムツメファシエンス によって媒介されるワンステップ形質転換方法の詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
Agrobacterium rhizogenesを介した毛状根の形質転換を用いて、トランスジェニック根と非トランスジェニック茎および芽を有する複合植物を作製することは、根関連の生物学を研究するための強力なツールです。毛状根の形質転換は、広範囲の双子葉植物およびいくつかの単子葉植物種において確立されており、遺伝子型とはほとんど無関係である。複合植物を得るためのA.根茎による胚軸注射の伝統的な方法は、非効率的で、時間がかかり、面倒であり、そしてしばしば柔らかくて小さな胚軸植物の死を引き起こす。A. rhizogenesによって媒介される非常に効率的なワンステップの毛状根形質転換が以前に確立されており、毛状根を生成した後の移植の必要性がなくなりました。この研究では、部分的な胚軸と一次根を取り除き、胚軸切開部位をA.リゾゲネスでコーティングし、次に胚軸を滅菌バーミキュライトに植えました。12日間の栽培後,胚軸切開部が拡大し,新たな毛状根が誘導された.本稿では、A. rhizogenesが媒介するワンステップ形質転換法の詳細なプロトコルを提供し、野生ダイズ、ナスアメリカナム、カボチャの複合植物を生産することによってその有効性を実証します。
Introduction
アグロバクテリウム根粒菌は、リゾビア科のグラム陰性土壌細菌です。 A.根粒菌は、ほとんどすべての双子葉植物、いくつかの単子葉植物、および個々の裸子植物に創傷を介して感染し、感染した植物に毛状の根を作り出す可能性があります。細菌はRi(根誘導)プラスミドを持ち、RiプラスミドのT-DNAはオピン合成遺伝子とロール遺伝子(根座遺伝子)を持っています。RiプラスミドのT-DNAが植物細胞に入り、宿主染色体に組み込まれた後、ロール遺伝子の発現により毛状根の産生が誘導されます1。目的遺伝子を持つ植物二元発現ベクターをA.リゾゲネスに形質転換し、形質転換したA.リゾゲネスを用いて植物に感染させる。 トランスジェニック根は、感染した植物において誘導され得、トランスジェニック根および非トランスジェニック茎および芽を含む複合植物を産生する。一般的に、複合植物は14-20日以内に得ることができます。A. 根茎媒介の毛状根形質転換は、一般に双子葉植物の遺伝子型によって制限されない2.A. rhizogenesに感染した植物が産生する毛状の根は、成長速度が速く、遺伝が安定しており、操作が簡単なという特徴があります。A. rhizogenesによって媒介される毛状根の形質転換は、現在、根関連生物学の研究に広く使用されている。さらに、毛状根の形質転換は、CRISPR/Cas9システム3,4,5およびタンパク質細胞内局在の標的編集効率を検証および最適化するためにも使用できます。したがって、毛状根の形質転換は、植物の遺伝子機能、代謝工学、および根と根圏微生物との相互作用に関する研究において重要なツールです6,7,8。
毛状根の形質転換によって得られたトランスジェニック根を含む複合植物は、双子葉植物、特にマメ科植物で広く生産されています。胚軸にA.リゾゲネスを注入する伝統的な方法は、複合ロータスコルニキュラタス9、大豆10、トマト11、サツマイモ12、および他の多くの植物5,8を生産するために使用されてきました。胚軸注射法は非効率的であり、若いまたは小さな胚軸植物の死を引き起こす可能性があります。そこで,胚根を切り取り,苗の切開部にA. rhizogenesを塗布した後,発根栽培用無菌培地に胚軸を置くことで方法を改良した13。しかしながら、これらのステップは無菌環境で行われ、操作ステップは比較的煩雑である。特に、得られた複合植物は移植する必要があり、それは作業量を増加させる。以前の研究では、キュウリ、ダイズ、ハスジャポニクス、メディカゴトランカチュラ、およびトマト2,14,15,16,17でワンステップA.リゾゲネス媒介(ARM)毛状根形質転換が確立されました。一次根と部分的な胚軸を取り除き、残りの胚軸の切開部位を形質転換A.リゾゲネスでコーティングし、その後、苗を湿った滅菌バーミキュライトに植えました。12日間の栽培後、切開部位に毛状の根ができました。ワンステップARM法は非常に効率的で、毛状の根を作るのに必要な時間が短くて済みます。毛状の根を形成した後の移植も必要ではありません。微生物汚染は移植なしで回避できるため、ワンステップARM法は、マメ科植物と根粒菌の間の共生窒素固定、植物とアーバスキュラー菌根菌の間の共生など、植物と微生物間の相互作用を研究する場合に特に役立ちます。この論文では、野生ダイズ、ナスアメリカナム、およびカボチャで生産された複合植物の例を使用して、詳細なワンステップA.リゾゲネスを介した毛状根の形質転換プロトコルを提供します。このプロトコルにより、研究者はワンステップのARM変換をスムーズに実行できます。
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Protocol
1. 植物の生育条件と A. rhizogenes の培養
- 種まき
注:野生の大豆の種子は、中国の聊城市楊谷県で収集されました。 S. americanum の種子とカボチャの地元の品種Yinsuは市場から購入しました。- 野生の大豆、 S. americanum、および地元の種類のカボチャの種子を集め、1 cmの深さでバーミキュライトに播種し、十分に水をやります。8 cm x 11 cm x 9 cmのプラスチックの箱に20個の種子を植えます。24 ± 2°Cの成長チャンバーで、相対湿度約70%で16時間の明暗/ 8時間の暗サイクルで植物を栽培します。
注:野生の大豆種子のコートは、播種する前に割る必要があります。研究の質問が植物と微生物の間の相互作用に焦点を当てている場合、種子、バーミキュライト、プラスチックの箱、および水は使用前に滅菌する必要があります。 - A. rhizogenes K599の活性化と培養
注:A.リゾゲネスK599株は、赤色蛍光レポーター遺伝子DsRed2を有する1つのバイナリベクターpRed13052を有していた。- A. rhizogenes K599株を-80°Cの冷凍庫から取り出し、固体LB培地(50 mg/Lカナマイシンおよび50 mg/Lストレプトマイシンを含む)で28°Cで48時間細菌を活性化します。
- K599株の単一クローンを選び出し、1 mLの液体抗生物質含有LB培地で12時間培養します。
- 500 μLの細菌懸濁液を抗生物質含有固体LB培地に均一に広げ、28°Cで24時間インキュベートします。
- 野生の大豆、 S. americanum、および地元の種類のカボチャの種子を集め、1 cmの深さでバーミキュライトに播種し、十分に水をやります。8 cm x 11 cm x 9 cmのプラスチックの箱に20個の種子を植えます。24 ± 2°Cの成長チャンバーで、相対湿度約70%で16時間の明暗/ 8時間の暗サイクルで植物を栽培します。
2. ワンステップ A.根茎媒介有毛根形質転換法
- 胚軸切開
- 7日後(種子の播種を0日目と定義)、実生子葉が展開したばかりで(図1A)、滅菌した鋭利なメスを使用して胚軸の約0.5〜1 cmを切断します(図1B)。一次根と部分的な胚軸の一部を破棄します。
注意: メスは注意して使用してください。
- 7日後(種子の播種を0日目と定義)、実生子葉が展開したばかりで(図1A)、滅菌した鋭利なメスを使用して胚軸の約0.5〜1 cmを切断します(図1B)。一次根と部分的な胚軸の一部を破棄します。
- K599接種
- 胚軸切開部をK599細菌でコーティングします(図1C)。
- 湿ったバーミキュライトに苗を植えます(図1D)。
- A. rhizogenesを介した毛状根の形質転換を介して、各種の30の植物に感染する。4分の1強度(0.25倍)のガンボーグB-5基本培地に5 mLの再懸濁したK599細菌懸濁液(OD600 = 0.5-0.6)で各植物に水をやります(図1E)。
- ポットを透明度の高いビニール袋(図1F)で覆い、成長チャンバーに入れます。
3.毛深い根の生産
- 接種後~12日間植物を成長させると、新しい毛状の根が誘導され、切開部位に生成されます。15日後、毛深い根の長さは通常2〜5 cmに達します(図2)。
- 産生された毛状根がトランスジェニックであるかどうかを決定するために、K599における形質転換ベクターに依存するレポーター遺伝子の発現を調べる。
- 540 nmで緑色励起光と600 nmで発光する化学発光イメージングシステムを使用して、レポーター遺伝子DsRed2の発現を検出します(図2B、図2D、および図2F)。
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Representative Results
高効率ワンステップ A.リゾゲネス媒介有毛根形質転換
人工K599接種後12日目に胚軸切開部位に毛状根を作製した。トランスジェニック毛状根は、バイナリーベクターに含まれるレポーター遺伝子の発現に基づいて決定した。複合野生ダイズ、S. americanum、およびカボチャのレポーター遺伝子DsRed2で形質転換されたトランスジェニック根を、自然(図2A、図2C、および図2E)および緑色励起光(図2B、図2D、および 図2F)で観察しました。
複合植物が少なくとも1つのトランスジェニック根を含む場合、それはトランスジェニック複合植物と呼ばれた。3種それぞれ接種した30株のうち,野生ダイズ28株, アメリカーナ科 18株,カボチャ30株がトランスジェニック複合物であった。したがって、毛状根の形質転換効率は93.3%(ダイズ)、60%(アメリカン)、および100%(カボチャ)であった。3種類の植物を比較すると、胚軸が厚い植物は、胚軸が薄い植物よりもトランスジェニックな毛状根が多く生成することが示されました。
図1:ワンステップ A.根粒菌を介した毛状根の形質転換。 (A)生後7日分のカボチャの苗。(B)K599菌液で切断した胚軸の頂端部分。(c)胚軸切開部をコーティングするK599細菌塊。(D)湿った無菌のバーミキュライトに植えられた外植片。(E)5 mLの再懸濁したK599細菌溶液を4分の1強度(0.25倍)ガンボルグB-5基本培地に散水します。(F)透明度の高いビニール袋カバー。スケールバー = 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ワンステップA.リゾゲネス媒介毛根形質転換から得られた複合植物。 (A,B)野生ダイズ、(C,D)ナスアメリカナム、および(E,F)カボチャの複合植物の根を(A,C,E)天然および(B,D,F)緑色励起光の下で。白い矢印はトランスジェニック毛状根を示します。黒い矢印は非トランスジェニックの毛状根を示す。スケールバー = 1 cm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ワンステップ A.リゾゲネス媒介毛根法は、胚軸注入法よりも単純で効率的な複合植物の生産方法です。ワンステップARM法は、毛状根の形質転換の効率を大幅に向上させ、毛状根を生成する時間を短縮し、毛状根の数を増やし、関連する作業量を減らします。改良された形質転換プロトコルは、マメ科植物と根粒菌の間、および植物とアーバスキュラー菌根菌の間の共生に関する研究に最適です。これは、毛状根の生産後の複合植物の移植が不要であり、移植中に生じる非接種株による汚染を回避するという事実に起因し得る。さらに、形質転換効率は1つの植物種(カボチャ)で100%であった。
以下の理由は、毛状根の形質転換において、ワンステップARM法が胚軸注射法よりも効率的であった理由を説明する可能性があります。まず、一次根を除去したが、苗の蒸散は維持された。これにより、蒸散引きは切開部における胚軸細胞へのA .リゾゲネス 浸潤を促進した。第2に,胚軸切開による創傷面積は胚軸注射法による創傷面積よりも大きかったため, A. rhizogenesの感染植物細胞が多かった。最後に、一次根を除去した後、胚軸切開部を暗くて湿ったバーミキュライトに埋め、根18を生成するのに好ましい環境である。
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Disclosures
著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、聊城大学研究基金(318012028)と山東省自然科学財団(ZR2020MC034)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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