Summary
Aquí, proporcionamos el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por Agrobacterium tumefaciens para producir plantas compuestas.
Abstract
La producción de plantas compuestas con raíces transgénicas y tallos y yemas no transgénicos utilizando la transformación de raíces pilosas mediada por Agrobacterium rhizogenes es una herramienta poderosa para estudiar la biología relacionada con las raíces. La transformación de la raíz pilosa se establece en una amplia gama de dicotiledóneas y en varias especies de monocotiledóneas y es casi independiente del genotipo. El método tradicional de inyección de hipocótilo con A. rhizogenes para obtener plantas compuestas es ineficiente, requiere mucho tiempo, es laborioso y con frecuencia causa la muerte de plantas de hipocótilo tiernas y diminutas. Previamente se estableció una transformación de raíz pilosa altamente eficiente de un solo paso mediada por A. rhizogenes , lo que elimina la necesidad de trasplante después de producir raíces pilosas. En este estudio, se extirpó un hipocótilo parcial y una raíz primaria, se recubrió el sitio de incisión del hipocótilo con A. rhizogenes y luego se plantaron hipocótilos en vermiculita estéril. Después de 12 días de cultivo, la incisión del hipocótilo se expandió y se indujeron nuevas raíces pilosas. Este artículo proporciona el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por A. rhizogenes, cuya eficacia se ha demostrado mediante la producción de plantas compuestas de soja silvestre, Solanum americanum y calabaza.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes es una bacteria gramnegativa del suelo de la familia Rhizobiaceae. A. rhizogenes puede infectar casi todas las dicotiledóneas, algunas monocotiledóneas y gimnospermas individuales a través de heridas, produciendo raíces pilosas en las plantas infectadas. La bacteria es portadora del plásmido Ri (inductor de raíces), y el ADN-T del plásmido Ri es portador del gen de síntesis de opina y de los genes de rol (genes del locus de la raíz). Después de que el ADN-T del plásmido Ri entra en una célula vegetal y se integra en un cromosoma huésped, la expresión de los genes del rol induce la producciónde raíces pilosas. Un vector de expresión binaria de una planta portador de un gen diana se transforma en A. rhizogenes, y el A. rhizogenes transformado se utiliza para infectar una planta. Las raíces transgénicas pueden ser inducidas en plantas infectadas, produciendo plantas compuestas que contienen raíces transgénicas y tallos y yemas no transgénicos. Generalmente, una planta compuesta se puede obtener en un plazo de 14 a 20 días. La transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes generalmente no está limitada por el genotipo en las plantas dicotiledóneas2. Las raíces peludas producidas por plantas infectadas con A. rizogenes se caracterizan por una tasa de crecimiento rápida, una herencia estable y una fácil operación. La transformación de la raíz pilosa mediada por A. rhizogenes se utiliza actualmente ampliamente para estudiar la biología relacionada con la raíz. Además, la transformación de las raíces pilosas también se puede utilizar para validar y optimizar la eficiencia de edición de objetivos del sistema CRISPR/Cas9 3,4,5 y la localización subcelular de proteínas. Por lo tanto, la transformación de la raíz pilosa es una herramienta importante en la investigación sobre la función de los genes de las plantas, la ingeniería metabólica y las interacciones entre las raíces y los microorganismos de la rizosfera 6,7,8.
Las plantas compuestas que contienen raíces transgénicas obtenidas a través de la transformación de raíces pilosas se han producido ampliamente en plantas dicotiledóneas, especialmente en leguminosas. El método tradicional de inyectar el hipocótilo con A. rhizogenes se ha utilizado para producir Lotus corniculatus9, soja 10, tomate11, batata12 y muchas otras plantas 5,8. El método de inyección de hipocótilo es ineficiente y es probable que cause la muerte de plantas jóvenes o diminutas de hipocótilo. Por lo tanto, el método se mejoró cortando las raíces embrionarias, cubriendo la incisión de la plántula con A. rhizogenes y luego colocando el hipocótilo en un medio de cultivo estéril para el cultivo de enraizamiento13. Sin embargo, esos pasos se realizan en un entorno estéril y los pasos de la operación son relativamente engorrosos. En particular, las plantas compuestas resultantes deben trasplantarse, lo que aumenta la cantidad de trabajo. En trabajos anteriores, se estableció la transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes (ARM) en un solo paso en pepino, soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula y tomate 2,14,15,16,17. Se eliminaron la raíz primaria y el hipocótilo parcial, el sitio de incisión del hipocótilo restante se recubrió con A. rizogenes transformado y la plántula se plantó en vermiculita estéril húmeda. Después de 12 días de cultivo, se produjeron raíces pilosas en el sitio de la incisión. El método ARM de un solo paso es altamente eficiente y requiere menos tiempo para producir raíces pilosas. Tampoco es necesario trasplantar después de formar raíces peludas. Debido a que la contaminación microbiana se puede evitar sin trasplante, el método ARM de un solo paso puede ser particularmente útil cuando se estudian las interacciones entre plantas y microorganismos, como la fijación simbiótica de nitrógeno entre plantas leguminosas y rizobios, y simbiosis entre plantas y hongos micorrícicos arbusculares. En este artículo, se proporciona un protocolo detallado de transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes de un solo paso con ejemplos de plantas compuestas producidas en soja silvestre, Solanum americanum y calabaza. Con el protocolo, los investigadores pueden realizar sin problemas la transformación de ARM en un solo paso.
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Protocol
1. Condiciones de crecimiento de las plantas y cultivo de A. rhizogenes
- Siembra de semillas
NOTA: Se recolectaron semillas de soja silvestre en el condado de Yanggu, Liaocheng, China; Las semillas de S. americanum y la variedad local de calabaza Yinsu se compraron en un mercado.- Recoja semillas de soja silvestre , S. americanum y la variedad local de calabaza, siémbralas en vermiculita a una profundidad de 1 cm y riéguelas bien. Planta 20 semillas en cajas de plástico de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivar las plantas en una cámara de crecimiento a 24 ± 2 °C con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad a aproximadamente un 70% de humedad relativa.
NOTA: Las capas de semillas de soja silvestre deben romperse antes de la siembra. Si la pregunta de investigación se centra en las interacciones entre las plantas y los microorganismos, las semillas, la vermiculita, las cajas de plástico y el agua deben esterilizarse antes de su uso. - Activación y cultivo de A. rhizogenes K599
NOTA: La cepa K599 de A. rhizogenes tenía un vector binario pRed13052 portador de un gen reportero fluorescente rojo DsRed2.- Retirar la cepa K599 de A. rhizogenes de un congelador a -80 °C y activar las bacterias en medio LB sólido (con 50 mg/L de kanamicina y 50 mg/L de estreptomicina) a 28 °C durante 48 h.
- Seleccionar un solo clon de la cepa K599 y cultivarlo en 1 mL de medio LB líquido que contenga antibióticos durante 12 h.
- Distribuir uniformemente 500 μL de la suspensión bacteriana en un medio LB sólido que contenga antibióticos, seguido de una incubación a 28 °C durante 24 h.
- Recoja semillas de soja silvestre , S. americanum y la variedad local de calabaza, siémbralas en vermiculita a una profundidad de 1 cm y riéguelas bien. Planta 20 semillas en cajas de plástico de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivar las plantas en una cámara de crecimiento a 24 ± 2 °C con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad a aproximadamente un 70% de humedad relativa.
2. Método de transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes en un solo paso
- Incisión de hipocótilo
- Después de 7 días (defina la siembra de las semillas como el día 0), los cotiledones de las plántulas acaban de desplegarse (Figura 1A), use un bisturí esterilizado y afilado para cortar aproximadamente 0,5-1 cm del hipocótilo (Figura 1B). Deseche la raíz primaria y parte del hipocótilo parcial.
NOTA: Utilice el bisturí con cuidado.
- Después de 7 días (defina la siembra de las semillas como el día 0), los cotiledones de las plántulas acaban de desplegarse (Figura 1A), use un bisturí esterilizado y afilado para cortar aproximadamente 0,5-1 cm del hipocótilo (Figura 1B). Deseche la raíz primaria y parte del hipocótilo parcial.
- Inoculación de K599
- Cubra la incisión del hipocótilo con la bacteria K599 (Figura 1C).
- Plante las plántulas en vermiculita húmeda (Figura 1D).
- Infecta 30 plantas de cada especie a través de la transformación de la raíz peluda mediada por A. rhizogenes. Riegue cada planta con 5 mL de suspensión bacteriana K599 resuspendida (OD600 = 0.5-0.6) en un medio básico Gamborg B-5 de concentración de un cuarto (0.25x) (Figura 1E).
- Cubra las macetas con una bolsa de plástico muy transparente (Figura 1F) y colóquelas en una cámara de crecimiento.
3. Producción de raíces pilosas
- Cultive las plantas durante ~ 12 días después de la inoculación, se inducirán y generarán nuevas raíces peludas en el sitio de la incisión. Después de 15 días, la longitud de las raíces pilosas suele alcanzar los 2-5 cm (Figura 2).
- Para determinar si las raíces pilosas producidas son transgénicas, se examina la expresión de genes reporteros dependientes del vector transformado en K599.
- Detecte la expresión del gen reportero DsRed2 utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia con luz de excitación verde a 540 nm y emisión a 600 nm (Figura 2B, Figura 2D y Figura 2F).
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Representative Results
Transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes en un solo paso altamente eficiente
Las raíces pilosas se produjeron en el sitio de incisión del hipocótilo 12 días después de la inoculación con K599 diseñado. Las raíces pilosas transgénicas se determinaron a partir de la expresión del gen reportero contenido en el vector binario. Se observaron raíces transgénicas transformadas con el gen reportero DsRed2 de soja silvestre compuesta, S. americanum y calabaza bajo luz de excitación natural (Figura 2A, Figura 2C y Figura 2E) y verde (Figura 2B, Figura 2D y Figura 2F).
Cuando una planta compuesta contenía al menos una raíz transgénica, se designaba como planta compuesta transgénica. Entre las 30 plantas inoculadas de cada una de las tres especies, 28 plantas silvestres de soja, 18 de S. Americanum y 30 de calabaza fueron compuestos transgénicos. Así, la eficiencia de transformación de la raíz pilosa fue de 93,3% (soja), 60% (S. americanum) y 100% (calabaza). Una comparación de los tres tipos de plantas indicó que las plantas con hipocótilos gruesos producían más raíces peludas transgénicas que aquellas con hipocótilos delgados.
Figura 1: Transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes en un solo paso. (A) Plántulas de calabaza de siete días de edad. (B) Porción apical de hipocótilo cortada en solución bacteriana K599. (C) Masa bacteriana K599 que recubre la incisión del hipocótilo. (D) Explante plantado en vermiculita húmeda y estéril. (E) Riego con 5 mL de solución bacteriana K599 resuspendida en un medio básico Gamborg B-5 de concentración de un cuarto (0,25x). (F) Cubierta de bolsa de plástico altamente transparente. Barras de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Plantas compuestas obtenidas a partir de la transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes en un solo paso. Raíces de plantas compuestas de soja silvestre (A,B), (C,D) Solanum americanum y calabaza (E,F) bajo luz de excitación natural (A,C,E) y (B,D,F) verde. Las flechas blancas indican raíces peludas transgénicas; Las flechas negras indican raíces peludas no transgénicas. Barras de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de raíz pilosa mediada por A. rizogenes en un solo paso es un método más simple y eficiente para producir plantas compuestas que el método de inyección de hipocótilo. El método ARM de un solo paso mejora significativamente la eficiencia de la transformación de las raíces pilosas, acorta el tiempo para producir raíces pilosas, aumenta el número de raíces pilosas y reduce la cantidad de trabajo involucrado. El protocolo de transformación mejorado es óptimo para estudios de simbiosis entre leguminosas y rizobios y entre plantas y hongos micorrícicos arbusculares. Esto se puede atribuir al hecho de que no se requiere el trasplante de plantas compuestas después de la producción de raíces peludas, lo que evita la contaminación con cepas no inoculadas que ocurre durante el trasplante. Además, la eficiencia de transformación fue del 100% en una especie vegetal (calabaza).
Las siguientes razones podrían explicar por qué el método ARM de un solo paso fue más eficiente que el método de inyección de hipocótilo en la transformación de la raíz pilosa. En primer lugar, aunque se eliminó la raíz primaria, se mantuvo la transpiración de las plántulas. Por lo tanto, el tirón de transpiración facilitó la invasión de A. rhizogenes de las células del hipocótilo en la incisión. En segundo lugar, el área de la herida causada por la incisión del hipocótilo fue mayor que la causada por el método de inyección de hipocótilo y, por lo tanto, más células vegetales fueron infectadas por A. rhizogenes. Por último, después de eliminar la raíz primaria, la incisión del hipocótilo se enterró en vermiculita oscura y húmeda, que es un ambiente favorable para producir raíces18.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo del Fondo de Investigación de la Universidad de Liaocheng (318012028) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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