يتم تقديم بروتوكول لتقييم ما إذا كانت EVs الصغيرة (sEVs) المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل الحاجز الدموي الدماغي في إناث الفئران البالغة غير الحوامل.
وتشكل المضاعفات الدماغية الوعائية، بما في ذلك الوذمة الدماغية والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية، السبب الرئيسي لوفيات الأمهات المرتبطة بمقدمات الارتعاج. الآليات الكامنة وراء هذه المضاعفات الدماغية الوعائية لا تزال غير واضحة. ومع ذلك ، فهي مرتبطة بخلل المشيمة واضطراب حاجز الدم في الدماغ (BBB). ومع ذلك ، لا يزال يتم تحديد العلاقة بين هذين الجهازين البعيدين. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المشيمة تطلق جزيئات الإشارة ، بما في ذلك الحويصلات خارج الخلية ، في الدورة الدموية للأم. يتم تصنيف الحويصلات خارج الخلية وفقا لحجمها ، مع الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs أصغر من 200 نانومتر في القطر) تعتبر جزيئات إشارات حرجة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في تسمم الحمل ، هناك عدد متزايد من sEVs المتداولة في الدورة الدموية للأمهات ، والتي لا يتم فهم وظيفة الإشارة إليها جيدا. تحفز التشوهات المشيمية التي يتم إطلاقها في مقدمات الارتعاج أو من مشيمة الحمل الطبيعية المعرضة لنقص الأكسجة الخلل البطاني في الدماغ وتعطيل BBB. في هذا البروتوكول ، نقوم بتقييم ما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل BBB في الجسم الحي.
ما يقرب من 70 ٪ من وفيات الأمهات بسبب تسمم الحمل ، ومتلازمة الحمل ارتفاع ضغط الدم التي تتميز بضعف عمليات المشيمة ، والخلل البطاني الجهازي للأم ، وفي الحالات الشديدة ، الفشل متعدد الأعضاء1،2 ، ترتبط بمضاعفات الأوعية الدموية الدماغية الحادة 3,4. تحدث معظم وفيات الأمهات في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل5. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة على الرغم من الأهمية السريرية والوبائية للمضاعفات الدماغية الوعائية المرتبطة بتسمم الحمل.
من ناحية أخرى ، تعد الحويصلات خارج الخلية (EVs) (القطر ~ 30-400 نانومتر) وسطاء أساسيين للتواصل بين الخلايا بين الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك التفاعل بين الأم والمشيمة6. بالإضافة إلى البروتينات والدهون على السطح الخارجي ، تحمل المركبات الكهربائية البضائع داخل (البروتينات والحمض النووي الريبي والدهون). يمكن تصنيف EVs إلى (1) exosomes (قطر ~ 50-150 نانومتر ، وتسمى أيضا EVs الصغيرة (sEVs)) ، (2) EVs متوسطة / كبيرة ، و (3) أجسام موت الخلايا المبرمج ، والتي تختلف حسب الحجم ، والتكوين الحيوي ، والمحتوى ، ووظيفة الإشارات المحتملة. يتم تحديد تكوين EVs من خلال الخلايا التي تنشأ منها ونوع المرض7. تعبر المركبات الكهربائية المشتقة من الأرومة المخلبية عن الفوسفاتيز القلوي المشيمي (PLAP)8,9 ، والذي يكتشف المركبات الكهربائية الصغيرة المنتشرة المشتقة من المشيمة (PDsEVs) أثناء الحمل. أيضا ، يساعد PLAP على تمييز التغيرات في حمولة PDsEVs وآثارها في تسمم الحمل مقابل الحمل المعياري10،11،12،13،14،15.
تم التعرف على المشيمة كعنصر ضروري في الفيزيولوجيا المرضية لتسمم الحمل16 أو المضاعفات الدماغية المرتبطة بهذا المرض17،18،19. ومع ذلك ، كيف يمكن لهذا العضو البعيد أن يحدث تغييرات في الدورة الدموية في الدماغ غير معروف. نظرا لأن sEVs تلعب أدوارا محورية في الاتصال من خلية إلى خلية نظرا لقدرتها على نقل المكونات النشطة بيولوجيا من الخلايا المانحة إلى الخلايا المتلقية6،20،21 ، فقد ربط عدد متزايد من الدراسات sEVs المشيمة بتوليد خلل وظيفي في بطانة الأم21،22،23،24 ، بما في ذلك الخلايا البطانية للدماغ25,26في النساء المصابات بتسمم الحمل. وبالتالي ، فإن حل وسط وظيفة بطانة الدماغ قد يؤدي إلى تعطيل الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، وهو عنصر حاسم في المضاعفات الوعائية الدماغية المرتبطة بتسمم الحمل3،27.
ومع ذلك ، فإن النتائج قبل السريرية باستخدام الأوعية الدماغية للفئران المعرضة لمصل النساء المصابات بتسمم الحمل28 أو الخلايا البطانية للدماغ البشري المعرضة لبلازما النساء المصابات بتسمم الحمل29 ذكرت أن العامل (العوامل) المنتشرة تحفز تعطيل BBB. على الرغم من وجود العديد من المرشحين الذين لديهم القدرة على إلحاق الضرر ب BBB الموجود في الدورة الدموية للأم أثناء تسمم الحمل ، مثل المستويات المرتفعة من السيتوكينات المسببة للالتهابات (أي عامل نخر الورم)18,28 أو منظمات الأوعية الدموية (أي عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF))29,30,31 ، أو الجزيئات المؤكسدة مثل البروتينات الدهنية المؤكسدة (oxo-LDL)32,33 ، من بين أمور أخرى34، لا يقيم أي منهم اتصالا مباشرا بين المشيمة و BBB. في الآونة الأخيرة ، أظهرت sEVs المعزولة من المشيمة التي تعاني من نقص الأكسجين القدرة على تعطيل BBB في الفئران الإناث غيرالحوامل 25. نظرا لأن sEVs المشيمة قد تحمل معظم العوامل المتداولة المدرجة مع القدرة على تعطيل BBB ، تعتبر sEVs مرشحة مناسبة لتوصيل المشيمة المصابة ، وتكون حاملة لعوامل الدورة الدموية الضارة ، وتعطل BBB في تسمم الحمل.
يسمح لنا هذا البروتوكول بالتحقيق فيما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين يمكن أن تعطل BBB في إناث الفئران غير الحوامل كوكيل لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمضاعفات الدماغية أثناء تسمم الحمل.
تكشف هذه الدراسة النقاب عن رؤى جديدة حول الضرر المحتمل الناتج عن sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظروف نقص الأكسجين على اضطراب حاجز الدم في دماغ القوارض. تتضمن الآلية المرضية انخفاضا في CLND-5 في منطقة الدماغ الخلفية25.
كشفت التحقيقات السابقة أن البلازما …
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا الباحثين الذين ينتمون إلى GRIVAS Health على مدخلاتهم القيمة. كما تنتمي القابلات والموظفون السريريون من خدمة أمراض النساء والتوليد إلى مستشفى دي شيلان ، تشيلي. أسسها فونديسيت العادية 1200250.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |