缺氧人胎盘来源的小细胞外囊泡破坏小鼠血脑屏障

摘要

本方案旨在评估在低氧条件下培养胎盘外植体（模拟子痫前期的某一特征）所分离出的小细胞外囊泡（sEVs）是否会破坏非妊娠成年雌性小鼠的血脑屏障。

摘要

脑血管并发症，包括脑水肿、缺血性卒中和出血性卒中，是子痫前期相关孕产妇死亡的首要原因。这些脑血管并发症的潜在机制尚不明确，但已知与胎盘功能障碍及血脑屏障（BBB）破坏有关。然而，这两个远端器官之间的关联机制仍有待阐明。越来越多的证据表明，胎盘会向母体循环系统释放包括细胞外囊泡在内的多种信号分子。细胞外囊泡根据其大小进行分类，其中直径小于200 nm的小细胞外囊泡（sEVs）被认为是生理和病理状态下重要的信号传递颗粒。在子痫前期，母体循环中的sEVs数量增加，但其信号功能尚未被充分理解。在子痫前期释放的胎盘sEVs，或由正常妊娠胎盘在缺氧条件下释放的sEVs，均可诱导脑血管内皮功能障碍及血脑屏障破坏。本实验方案旨在评估在缺氧条件下培养胎盘外植体所分离的sEVs（模拟子痫前期的某一特征）是否会导致血脑屏障的破坏 体内.

引言

约70%的子痫前期相关孕产妇死亡与急性脑血管并发症有关。子痫前期是一种以胎盘形成障碍、母体全身性血管内皮功能障碍以及在严重情况下出现多器官衰竭为特征的妊娠期高血压综合征^1,2。大多数孕产妇死亡发生在中低收入国家⁵。然而，尽管子痫前期相关的脑血管并发症具有重要的临床和流行病学意义，其潜在机制仍不明确^3,4。

另一方面，细胞外囊泡（EVs）（直径约30-400 nm）是组织和器官之间（包括母体-胎盘相互作用⁶）细胞间通讯的重要介质。除了表面携带的蛋白质和脂质外，EVs内部还含有多种物质（如蛋白质、RNA和脂质）。根据大小、生物发生方式、内容物及潜在的信号功能，EVs可分为三类：（1）外泌体（直径约50-150 nm，也称为小EVs（sEVs））；（2）中等/大型EVs；（3）凋亡小体。EVs的组成取决于其来源细胞类型以及疾病状态⁷。合体滋养层细胞来源的EVs表达胎盘碱性磷酸酶（PLAP）^8,9

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》所表达的原则，并在各伦理审查委员会的授权下进行。所有人类参与者在样本采集前均签署了知情同意书，如前所述。²⁵此外，比奥比奥大学的生物伦理与生物安全委员会批准了本项目（Fondecyt 资助编号 1200250）。动物实验严格遵循实验动物使用中“3R原则”的基本要求。³⁵，并遵循美国国立卫生研究院（US National Institute of Health）发布的《实验动物护理和使用指南》中的建议。动物饲养于比奥比奥大学（University of Bío-Bío）动物实验中心的适宜环境中。足月妊娠（妊娠38至41周）、年龄为28至31岁的健康产妇在智利奇廉市赫明达·马丁临床医院（Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chile）接受选择性剖宫产术后1小时内获取新鲜胎盘组织（n = 4），获取方法如先前报道所述。²⁵. 以应用 体内 模型采用4-6月龄雌性未孕小鼠（C57BLACK/6品系），分为三组实验组：（1）对照组（无处理），（2）经常氧培养胎盘来源sEVs（sEVs-Nor）处理组，（3）经低氧培养胎盘来源sEVs（sEVs-Hyp）处理组，用于评估血脑屏障（BBB）的破坏情况 体内²⁵所有注射溶液均为无菌。此外，sEVs....

结果

本方案旨在评估在低氧条件下培养的胎盘来源sEVs破坏非妊娠小鼠血脑屏障（BBB）的能力。该方法有助于更深入地理解胎盘与大脑在生理及病理状态下之间的潜在联系。特别是，该方法可作为分析胎盘sEVs在子痫前期相关脑部并发症发生中作用的间接手段。

与注射sEVs-Nor的小鼠不同，注射sEVs-Hyp的小鼠神经学评分持续下降至24小时（表1），表明sEVs-Hyp具有损害脑功能的能力。

此外，注射 sEVs-Hyp 的小鼠脑组织新鲜重量高于注射 sEVs-Nor 或对照组小鼠的脑组织（分别为 0.51 ± 0.008；0.46 ± 0.008；0.47 ± 0.01 g），这可能构成脑水肿的宏观指标⁴⁵。

与此发现一致，本方案可使人识别伊文思蓝外渗现象，作为血脑屏障（BBB）破坏的指标。在这方面，注射了sEVs-Hyp的小鼠脑组织比注射了sEVs-Nor的小鼠脑组织表现出更高的伊文思蓝外渗水平（

讨论

本研究揭示了在低氧条件下培养的人胎盘外植体所分离的小细胞外囊泡（sEVs）对啮齿类动物血脑屏障破坏的潜在危害。该病理机制涉及后脑区域CLND-5的减少²⁵。

既往研究表明，子痫前期患者的血浆sEV可诱导多种器官的内皮功能障碍 体外 模型^46,47本研究重点考察了血脑屏障，揭示了来自低氧培养胎盘的sEVs可破坏这一重要屏障，为该领域提供了新的视角。这些发现开辟了一个新的研究方向，即sEVs可能在正常及病理性妊娠（如子痫前期）等情况下，作为胎盘与大脑之间通讯的媒介。

本方案操作简便，但有几个关键步骤需要特别说明。本方案要求在分娩后1小时内获取新鲜胎盘。我们还建议不要将培养时间延长超过24小时，以防止组织降解。本方案可避免小鼠胎盘产生的小细胞外囊泡（sEVs）带来的潜在污染。伊文思蓝外渗的数字化分析较为耗时。此外，脑组织切片后伊文思蓝染色的可见度会降低.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成年小鼠脑切片矩阵 3D 打印	开放获取文件	成年小鼠	成年小鼠脑切片器，使用 PLA 丝材打印
抗 β-肌动蛋白一抗	Sigma-Aldrich	克隆 AC-74	用于上样对照（Western blot）的抗体
抗 Claudin5 一抗	Santa Cruz Biotechnology	sc-374221	用于检测小鼠血脑屏障紧密连接蛋白 CLDN5 的一抗（Western blot）
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225	用于测定蛋白浓度的试剂盒
培养基 #200 500 mL	Thermo Fisher Scientific	m200500	胎盘外植体培养用培养基
D180 CO2 培养箱	RWD Life Science	D180	用于稳定外植体及培养 sEVs-Nor 的标准培养箱
伊文思蓝染料  > 75% 10 g	Sigma-Aldrich	E2129.10G	用于体内分析血脑屏障破坏的染料
胎牛血清 500 mL	Thermo Fisher Scientific	16000044	培养基 200 的添加型生长因子
Himac 超速离心机 CP100NX	Himac eppendorf group	5720410101	用于条件培养基的超速离心（> 1,20,000 × g）
ImageJ 软件	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
异氟烷 100 mL	USP Baxter	212-094	用于小鼠的挥发性吸入麻醉剂
CellTiter 96 非放射性检测试剂盒	Promega	0000105232	体外 胎盘外植体活力检测
小鼠 IgG 二抗	Thermo Fisher Scientific	MO 63103	用于 CLDN5 检测的二抗（Western blot）
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	90278090	用于分析胎盘外植体条件培养基中颗粒的纳米追踪系统
多聚甲醛 E 97% 溶液 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A11313.22	用于脑组织切片及心脏灌注固定的固定液（稀释后使用）
PBS 1× pH 7.4 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010023	胎盘外植体洗涤液
青霉素-链霉素 100× 20 mL	Thermo Fisher Scientific	10378016	胎盘外植体培养基用抗生素
ProOX C21 细胞中心 O2 和 CO2 子室控制器	BioSpherix	SCR_021131	CO2 调节器，用于在密闭腔室中诱导低氧以制备 sEVs-Hyp
硫喷妥钠 1 g	Chemie	7061	人道安乐死试剂
Somnosuite 低流量麻醉系统	Kent Scientifics	SS-01	用于小型啮齿动物的异氟烷蒸发器
手术加热平台	Kent Scientifics	A41166	用于维持小鼠麻醉期间体温的加热平台
注射器滤器，聚四氟乙烯（PTFE），疏水性，0.22 µm，无菌，25 mm	Southern Labware	10026	用于过滤从胎盘外植体收获的条件培养基
台式高速微量离心机 HITACHI himac CT15E/CT15RE	Hitachi 医疗系统	6020	用于条件培养基的系列离心（< 1,20,000 × g）
三目体视显微镜，透射与反射光源，10x–160x	Center Medical	2597	用于记录脑切片的体视显微镜