एक प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है कि क्या छोटे ईवीएस (एसईवी) हाइपोक्सिक स्थितियों (प्रीक्लेम्पसिया के एक पहलू मॉडलिंग) के तहत सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग हैं, गैर-गर्भवती वयस्क महिला चूहों में रक्त-मस्तिष्क बाधा को बाधित करते हैं।
सेरेब्रल एडिमा और इस्केमिक और रक्तस्रावी स्ट्रोक सहित सेरेब्रोवास्कुलर जटिलताओं, प्रीक्लेम्पसिया से जुड़ी मातृ मृत्यु दर का प्रमुख कारण बनती हैं। इन मस्तिष्कवाहिकीय जटिलताओं के अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहते हैं। हालांकि, वे प्लेसेंटल डिसफंक्शन और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) व्यवधान से जुड़े हुए हैं। फिर भी, इन दो दूर के अंगों के बीच संबंध अभी भी निर्धारित किया जा रहा है। बढ़ते सबूत बताते हैं कि नाल मातृ परिसंचरण में बाह्य पुटिकाओं सहित सिग्नलिंग अणुओं को छोड़ती है। एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं को उनके आकार के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है, जिसमें छोटे बाह्य पुटिकाओं (व्यास में 200 एनएम से छोटे एसईवी) को शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग कण माना जाता है। प्रीक्लेम्पसिया में, मातृ परिसंचरण में परिसंचारी एसईवी की संख्या में वृद्धि हुई है, जिसके सिग्नलिंग फ़ंक्शन को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। प्रीक्लेम्पसिया में या सामान्य गर्भावस्था प्लेसेंटा से हाइपोक्सिया के संपर्क में आने वाले प्लेसेंटस से प्लेसेंटल एसईवी मस्तिष्क एंडोथेलियल डिसफंक्शन और बीबीबी के विघटन को प्रेरित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम आकलन करते हैं कि हाइपोक्सिक स्थितियों (प्रीक्लेम्पसिया के एक पहलू मॉडलिंग) के तहत सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग किए गए एसईवी विवो में बीबीबी को बाधित करते हैं या नहीं।
प्रीक्लेम्पसिया के कारण लगभग 70% मातृ मृत्यु, एक उच्च रक्तचाप से ग्रस्त गर्भावस्था सिंड्रोम बिगड़ा हुआ अपरा प्रक्रियाओं, मातृ प्रणालीगत एंडोथेलियल डिसफंक्शन, और, गंभीर मामलों में, बहु-अंग विफलता 1,2, तीव्र मस्तिष्कवाहिकीय जटिलताओं 3,4 से जुड़े हैं। अधिकांश मातृ मृत्यु निम्न और मध्यम आय वाले देशों में होती हैं। हालांकि, प्रीक्लेम्पसिया से जुड़े सेरेब्रोवास्कुलर जटिलताओं के नैदानिक और महामारी विज्ञान प्रासंगिकता के बावजूद अंतर्निहित तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं।
दूसरी ओर, बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) (व्यास ~ 30-400 एनएम) ऊतकों और अंगों के बीच अंतरकोशिकीय संचार के आवश्यक मध्यस्थ हैं, जिसमें मातृ-अपरा बातचीत6 शामिल है। बाहरी सतह पर प्रोटीन और लिपिड के अलावा, ईवीएस कार्गो (प्रोटीन, आरएनए और लिपिड) के भीतर ले जाते हैं। ईवीएस को (1) एक्सोसोम (व्यास ~ 50-150 एनएम, जिसे छोटे ईवीएस (एसईवी) भी कहा जाता है), (2) मध्यम/बड़े ईवी, और (3) एपोप्टोटिक निकायों में वर्गीकृत किया जा सकता है, जो आकार, जैवजनन, सामग्री और संभावित सिग्नलिंग फ़ंक्शन से भिन्न होते हैं। ईवीएस की संरचना उन कोशिकाओं द्वारा निर्धारित की जाती है जिनसे वे उत्पन्न होते हैं और रोग प्रकार7। Syncytiotrophoblast-व्युत्पन्न EVs प्लेसेंटल क्षारीय फॉस्फेट (PLAP)8,9 व्यक्त करते हैं, जो गर्भावस्था में प्लेसेन्टे-व्युत्पन्न परिसंचारी छोटे EVs (PDsEVs) का पता लगाता है। इसके अलावा, पीएलएपी पीडीएसईवी कार्गो में परिवर्तन और प्रीक्लेम्पसिया बनाम नॉर्मोटेंसिव गर्भधारण 10,11,12,13,14,15 में उनके प्रभावों को समझने में मदद करता है।
नाल प्रीक्लेम्पसिया16 या इस रोग 17,18,19 के साथ जुड़े मस्तिष्क जटिलताओं के pathophysiology में आवश्यक घटक के रूप में मान्यता दी गई है. हालांकि, यह दूर का अंग मस्तिष्क परिसंचरण में परिवर्तन को कैसे प्रेरित कर सकता है अज्ञात है। चूंकि एसईवी दाता से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं 6,20,21 तक बायोएक्टिव घटकों को स्थानांतरित करने की उनकी क्षमता के कारण सेल-टू-सेल संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसलिए अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं25,26 सहित मातृ एंडोथेलियल डिसफंक्शन 21,22,23,24 की पीढ़ी के साथ प्लेसेंटल एसईवी को जोड़ा हैप्रीक्लेम्पसिया वाली महिलाओं में। इस प्रकार, मस्तिष्क endothelial समारोह के समझौता रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी), प्रीक्लेम्पसिया 3,27 के साथ जुड़े मस्तिष्कवाहिकीय जटिलताओं में एक महत्वपूर्ण घटक के विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
फिर भी, प्रीक्लेम्पसिया 28 के साथ महिलाओं के सीरम के संपर्क में चूहे सेरेब्रल वाहिकाओं का उपयोग करने वाले प्रीक्लेम्पसिया28 या मानव मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ प्रीक्लेम्पसिया29 के साथ महिलाओं के प्लाज्मा के संपर्क में आने वाले प्रीक्लिनिकल निष्कर्षों ने बताया कि परिसंचारी कारक बीबीबी के व्यवधान को प्रेरित करते हैं। प्रीक्लेम्पसिया के दौरान मातृ परिसंचरण में मौजूद बीबीबी को नुकसान पहुंचाने की क्षमता वाले कई उम्मीदवारों के बावजूद, जैसे कि प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (यानी, ट्यूमर नेक्रोसिस कारक)18,28 या संवहनी नियामकों (यानी, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ))29,30,31, या ऑक्सीडेटिव अणु जैसे ऑक्सीकृत-लिपोप्रोटीन (ऑक्सो-एलडीएल)32,33, दूसरों के बीच34, उनमें से कोई भी नाल और बीबीबी के बीच सीधा संबंध स्थापित नहीं करता है। हाल ही में, हाइपोक्सिक प्लेसेंटा से अलग किए गए एसईवी ने गैर-गर्भवती महिला चूहों25 में बीबीबी को बाधित करने की क्षमता दिखाई है। चूंकि प्लेसेंटल एसईवी बीबीबी को बाधित करने की क्षमता के साथ अधिकांश सूचीबद्ध परिसंचारी कारकों को ले जा सकते हैं, इसलिए एसईवी को घायल प्लेसेंटा को जोड़ने के लिए उपयुक्त उम्मीदवार माना जाता है, हानिकारक परिसंचारी कारकों का वाहक होता है, और प्रीक्लेम्पसिया में बीबीबी को बाधित करता है।
यह प्रोटोकॉल हमें यह जांचने की अनुमति देता है कि क्या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग किए गए एसईवी प्रीक्लेम्पसिया के दौरान सेरेब्रल जटिलताओं के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने के लिए प्रॉक्सी के रूप में गैर-गर्भवती महिला चूहों में बीबीबी को बाधित कर सकते हैं।
यह अध्ययन कृंतक रक्त-मस्तिष्क बाधा के विघटन पर हाइपोक्सिक स्थितियों में सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग किए गए एसईवी के परिणामस्वरूप संभावित नुकसान में ताजा अंतर्दृष्टि का खुलासा करता है। …
The authors have nothing to disclose.
लेखक अपने मूल्यवान इनपुट के लिए GRIVAS Health से संबंधित शोधकर्ताओं को धन्यवाद देना चाहते हैं। इसके अलावा, प्रसूति और स्त्री रोग सेवा से दाइयों और नैदानिक कर्मचारी अस्पताल डी चिलान, चिली से संबंधित हैं। Fondecyt नियमित 1200250 द्वारा स्थापित।
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |