JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Forstyrrelse av musens blod-hjernebarriere av små ekstracellulære vesikler fra hypoksiske humane placentas

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

En protokoll presenteres for å evaluere om små EVs (sEVs) isolert fra placentaplanter dyrket under hypoksiske forhold (modellering av et aspekt av preeklampsi) forstyrrer blod-hjernebarrieren hos ikke-gravide voksne kvinnelige mus.

Abstract

Cerebrovaskulære komplikasjoner, inkludert cerebralt ødem og iskemisk og hemoragisk slag, utgjør den viktigste årsaken til mødredødelighet forbundet med preeklampsi. De underliggende mekanismene til disse cerebrovaskulære komplikasjonene er fortsatt uklare. Imidlertid er de knyttet til placenta dysfunksjon og blod-hjernebarriere (BBB) forstyrrelse. Likevel er forbindelsen mellom disse to fjerne organene fortsatt bestemt. Økende bevis tyder på at moderkaken frigjør signalmolekyler, inkludert ekstracellulære vesikler, i mors sirkulasjon. Ekstracellulære vesikler er kategorisert i henhold til deres størrelse, med små ekstracellulære vesikler (sEVs mindre enn 200 nm i diameter) betraktet som kritiske signalpartikler i både fysiologiske og patologiske forhold. I preeklampsi er det et økt antall sirkulerende sEV i mors sirkulasjon, hvis signalfunksjon ikke er godt forstått. Placental sEVs utgitt i preeklampsi eller fra normal graviditet placentas utsatt for hypoksi indusere hjernen endotelial dysfunksjon og forstyrrelse av BBB. I denne protokollen vurderer vi om sEV isolert fra placentaplanter dyrket under hypoksiske forhold (modellering av et aspekt av preeklampsi) forstyrrer BBB in vivo.

Introduction

Omtrent 70% av mødredødsfall på grunn av preeklampsi, et hypertensivt graviditetssyndrom preget av svekkede placentasjonsprosesser, maternell systemisk endoteldysfunksjon og i alvorlige tilfeller multiorgansvikt 1,2, er assosiert med akutte cerebrovaskulære komplikasjoner 3,4. De fleste mødredødsfall forekommer i lav- og mellominntektsland5. Imidlertid er de underliggende mekanismene fortsatt uklare til tross for den kliniske og epidemiologiske relevansen av cerebrovaskulære komplikasjoner assosiert med preeklampsi.

På den annen side er ekstracellulære vesikler (EV) (diameter ~ 30-400 nm) essensielle mediatorer for intercellulær kommunikasjon mellom vev og organer, inkludert mors placentainteraksjon6. I tillegg til proteiner og lipider på den ytre overflaten, bærer elbiler last innenfor (proteiner, RNA og lipider). EV-er kan kategoriseres i (1) eksosomer (diameter ~ 50-150 nm, også kalt små EV-er (sEVs)), (2) mellomstore / store EV-er og (3) apoptotiske kropper, som varierer etter størrelse, biogenese, innhold og potensiell signalfunksjon. Sammensetningen av elbiler bestemmes av cellene de kommer fra og sykdomstypen7. Syncytiotrofoblast-avledede EVer uttrykker placenta alkalisk fosfatase (PLAP) 8,9, som oppdager placentae-avledede sirkulerende små EVs (PDsEVsEVs) i svangerskapet. PLAP hjelper også med å skjelne endringer i PDsEVs last og deres effekter i preeklampsi versus normotensive graviditeter 10,11,12,13,14,15.

Morkaken har blitt anerkjent som den nødvendige komponenten i patofysiologien av preeklampsi16 eller cerebrale komplikasjoner forbundet med denne sykdommen 17,18,19. Men hvordan dette fjerne organet kan indusere endringer i hjernens sirkulasjon er ukjent. Siden sEV spiller sentrale roller i celle-til-celle-kommunikasjon på grunn av deres evne til å overføre bioaktive komponenter fra donor til mottakerceller 6,20,21, har et økende antall studier assosiert placenta sEVs med genereringen av mors endoteldysfunksjon 21,22,23,24, inkludert hjerneendotelceller 25,26hos kvinner med svangerskapsforgiftning. Dermed kan kompromittering av hjernens endotelfunksjon føre til forstyrrelse av blod-hjernebarrieren (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulære komplikasjoner forbundet med preeklampsi 3,27.

Likevel rapporterte prekliniske funn ved bruk av cerebral kar fra rotter eksponert for serum hos kvinner med svangerskapsforgiftning28 eller endotelceller i den menneskelige hjerne eksponert for plasma hos kvinner med preeklampsi29 at sirkulerende faktor(er) induserer forstyrrelse av BBB. Til tross for flere kandidater med potensial til å skade BBB som er tilstede i mors sirkulasjon under preeklampsi, for eksempel forhøyede nivåer av proinflammatoriske cytokiner (dvs. tumornekrosefaktor)18,28 eller vaskulære regulatorer (dvs. vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF))29,30,31, eller oksidative molekyler som oksiderte lipoproteiner (okso-LDL)32,33, blant andre34, ingen av dem etablerer en direkte forbindelse mellom morkaken og BBB. Nylig har sEVs isolert fra hypoksiske morkaker vist evnen til å forstyrre BBB hos ikke-gravide kvinnelige mus25. Siden placenta sEVs kan bære de fleste av de listede sirkulerende faktorene med kapasitet til å forstyrre BBB, anses sEVs som egnede kandidater for å koble den skadede morkaken, være bærer av skadelige sirkulerende faktorer og forstyrre BBB i preeklampsi.

Denne protokollen tillater oss å undersøke om sEVs isolert fra placenta explants dyrket under hypoksiske forhold kan forstyrre BBB hos ikke-gravide kvinnelige mus som en proxy for å forstå patofysiologien av cerebrale komplikasjoner under preeklampsi.

Protocol

Forskningen ble utført i henhold til prinsippene uttrykt i Helsinkideklarasjonen og under autorisasjon fra de respektive etiske vurderingsnemndene. Alle menneskelige deltakere ga sitt informerte samtykke før prøveinnsamling, som rapportert tidligere25. I tillegg godkjente komiteen for bioetikk og biosikkerhet ved Bío-Bío-universitetet dette prosjektet (Fondecyt grant 1200250). Dyrearbeidet ble utført i samsvar med kardinalprinsippene til de tre R-ene i bruk av dyr i forsøk…

Representative Results

Denne protokollen evaluerer kapasiteten til sEVs avledet fra placentas dyrket i hypoksi for å forstyrre BBB hos ikke-gravide mus. Denne metoden gjør det mulig å forstå bedre den potensielle forbindelsen mellom moderkaken og hjernen under normale og patologiske forhold. Spesielt kan denne metoden utgjøre en proxy for å analysere placenta sEVs deltakelse i begynnelsen av cerebrale komplikasjoner i preeklampsi. I motsetning til mus injisert med sEVs-Nor, viser mus injisert med sEVs-Hyp en p…

Discussion

Denne studien avslører ny innsikt i potensiell skade som følge av sEVs isolert fra placenta-eksplanter dyrket under hypoksiske forhold på forstyrrelsen av gnagerblod-hjernebarrieren. Den patologiske mekanismen innebærer en reduksjon i CLND-5 i den bakre hjerneregionen25.

Tidligere undersøkelser har vist at plasma-sEVs fra personer med preeklampsi induserer endoteldysfunksjon i forskjellige organer ved bruk av in vitro-modeller 46,47…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker forskerne tilknyttet GRIVAS Health for verdifulle innspill. Også jordmødre og klinisk personale fra Obstetrics and Gynecology Service tilhører Hospital de Chillan, Chile. Grunnlagt av Fondecyt Regular 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64 (2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5′-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia – A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68 (2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier – a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Tags

Keywords: Extracellular VesiclesBlood-brain BarrierPlacentaPreeclampsiaHypoxiaCerebrovascular ComplicationsMaternal MortalityBrain Endothelial Dysfunction
check_url/65867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image