JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Störning av blod-hjärnbarriären hos möss med hjälp av små extracellulära vesiklar från hypoxiska humana moderkakor

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

Ett protokoll presenteras för att utvärdera om små EV (sEV) isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden (modellering av en aspekt av havandeskapsförgiftning) stör blod-hjärnbarriären hos icke-dräktiga vuxna honmöss.

Abstract

Cerebrovaskulära komplikationer, inklusive hjärnödem och ischemisk och hemorragisk stroke, utgör den främsta orsaken till mödradödlighet i samband med havandeskapsförgiftning. De bakomliggande mekanismerna för dessa cerebrovaskulära komplikationer är fortfarande oklara. De är dock kopplade till placentadysfunktion och störningar i blod-hjärnbarriären (BBB). Sambandet mellan dessa två avlägsna organ håller dock fortfarande på att fastställas. Allt fler bevis tyder på att moderkakan frigör signalmolekyler, inklusive extracellulära vesiklar, i moderns cirkulation. Extracellulära vesiklar kategoriseras efter deras storlek, med små extracellulära vesiklar (sEV mindre än 200 nm i diameter) som kritiska signalpartiklar vid både fysiologiska och patologiska tillstånd. Vid havandeskapsförgiftning finns det ett ökat antal cirkulerande sEV i moderns cirkulation, vars signalfunktion inte är väl förstådd. Placenta sEV som frigörs vid havandeskapsförgiftning eller från moderkakor under normal graviditet som utsätts för hypoxi inducerar endoteldysfunktion i hjärnan och störning av BBB. I detta protokoll bedömer vi om sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden (modellering av en aspekt av preeklampsi) stör BBB in vivo.

Introduction

Cirka 70 % av mödradödligheten på grund av havandeskapsförgiftning, ett hypertensivt graviditetssyndrom som kännetecknas av försämrade placenteringsprocesser, maternell systemisk endoteldysfunktion och, i allvarliga fall, multiorgansvikt 1,2, är förknippade med akuta cerebrovaskulära komplikationer 3,4. Den största delen av mödradödligheten inträffar i låg- och medelinkomstländer5. De bakomliggande mekanismerna är dock fortfarande oklara, trots den kliniska och epidemiologiska relevansen av cerebrovaskulära komplikationer i samband med havandeskapsförgiftning.

Å andra sidan är extracellulära vesiklar (EV) (diameter ~30-400 nm) viktiga mediatorer för intercellulär kommunikation mellan vävnader och organ, inklusive interaktion mellan moder och placenta6. Förutom proteiner och lipider på den yttre ytan bär EV last inuti (proteiner, RNA och lipider). EV kan kategoriseras i (1) exosomer (diameter ~50-150 nm, även kallade små EV (sEV)), (2) medelstora/stora EV och (3) apoptotiska kroppar, som skiljer sig åt i storlek, biogenes, innehåll och potentiell signalfunktion. Sammansättningen av EV bestäms av de celler som de kommer från och sjukdomstypen7. Syncytiotrofoblast-härledda EV uttrycker placenta alkaliskt fosfatas (PLAP)8,9, som detekterar placentae-härledda cirkulerande små EV (PDsEV) under graviditeten. PLAP hjälper också till att urskilja förändringar i PDsEVs last och deras effekter vid havandeskapsförgiftning kontra normotensiva graviditeter 10,11,12,13,14,15.

Moderkakan har erkänts som den nödvändiga komponenten i patofysiologin för preeklampsi16 eller cerebrala komplikationer i samband med denna sjukdom 17,18,19. Hur detta avlägsna organ kan inducera förändringar i hjärnans cirkulation är dock okänt. Eftersom sEV spelar en avgörande roll i cell-till-cell-kommunikation på grund av deras förmåga att överföra bioaktiva komponenter från donator- till mottagarceller 6,20,21, har ett växande antal studier associerat placenta-sEV med generering av moderns endoteldysfunktion 21,22,23,24, inklusive endotelceller i hjärnan 25,26hos kvinnor med havandeskapsförgiftning. Således kan komprometteringen av hjärnans endotelfunktion leda till störningar i blod-hjärnbarriären (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulära komplikationer i samband med havandeskapsförgiftning 3,27.

Prekliniska fynd med cerebrala kärl hos råtta som exponerats för serum från kvinnor med preeklampsi28 eller endotelceller från human hjärna som exponerats för plasma från kvinnor med preeklampsi29 rapporterade dock att cirkulerande faktorer inducerar störning av BBB. Trots flera kandidater med potential att skada BBB som finns i moderns cirkulation under preeklampsi, såsom förhöjda nivåer av proinflammatoriska cytokiner (dvs. tumörnekrosfaktor)18,28 eller vaskulära regulatorer (dvs. vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF)))29,30,31, eller oxidativa molekyler såsom oxiderade lipoproteiner (oxo-LDL)32,33, bland annat34, ingen av dem visar att det finns ett direkt samband mellan moderkakan och BBB. Nyligen har sEV isolerat från hypoxiska moderkakor visat förmågan att störa BBB hos icke-dräktiga honmöss25. Eftersom sEV med moderkakan kan bära de flesta av de listade cirkulerande faktorerna med kapacitet att störa BBB, anses sEV vara lämpliga kandidater för att ansluta den skadade moderkakan, vara bärare av skadliga cirkulerande faktorer och störa BBB vid havandeskapsförgiftning.

Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka om sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden kan störa BBB hos icke-dräktiga honmöss som en proxy för att förstå patofysiologin för cerebrala komplikationer under preeklampsi.

Protocol

Forskningen har genomförts i enlighet med de principer som uttrycks i Helsingforsdeklarationen och med tillstånd av respektive etikprövningsnämnd. Alla mänskliga deltagare gav sitt informerade samtycke före provtagningen, som tidigare rapporterats25. Dessutom godkände bioetik- och biosäkerhetskommittén vid Bío-Bío-universitetet detta projekt (Fondecyt grant 1200250). Djurarbetet utfördes i enlighet med huvudprinciperna för de tre R:en vid användning av djur i försök<sup class="xref…

Representative Results

Detta protokoll utvärderar förmågan hos sEV som härrör från moderkakor odlade i hypoxi att störa BBB hos icke-dräktiga möss. Denna metod gör det möjligt att bättre förstå den potentiella kopplingen mellan moderkakan och hjärnan under normala och patologiska tillstånd. I synnerhet kan denna metod utgöra en proxy för att analysera placenta sEVs deltagande i uppkomsten av cerebrala komplikationer vid havandeskapsförgiftning. Till skillnad från möss som injicerats med sEVs-Nor…

Discussion

Denna studie avslöjar nya insikter om potentiella skador till följd av sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden på störningen av gnagarblod-hjärnbarriären. Den patologiska mekanismen innebär en minskning av CLND-5 i den bakre hjärnregionen25.

Tidigare undersökningar har visat att plasma-sEV från individer med havandeskapsförgiftning inducerar endoteldysfunktion i olika organ med hjälp av in vitro-modeller <sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka forskarna som tillhör GRIVAS Health för deras värdefulla bidrag. Även barnmorskor och klinisk personal från obstetrik och gynekologi tillhör Hospital de Chillan, Chile. Grundat av Fondecyt Regular 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64 (2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5′-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia – A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68 (2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier – a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Tags

Keywords: Extracellular VesiclesBlood-brain BarrierPlacentaPreeclampsiaHypoxiaCerebrovascular ComplicationsMaternal MortalityBrain Endothelial Dysfunction
check_url/65867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image