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Medicine

低酸素性ヒト胎盤由来の小細胞外小胞によるマウス血液脳関門の破壊

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

低酸素条件下で培養された胎盤外植片から単離された小型EV(sEV)が、妊娠していない成体雌マウスの血液脳関門を破壊するかどうかを評価するためのプロトコルが提示されています。

Abstract

脳浮腫、虚血性および出血性脳卒中などの脳血管合併症は、子癇前症に関連する妊産婦死亡率の主な原因を構成しています。これらの脳血管合併症の根本的なメカニズムは不明のままです。しかし、それらは胎盤機能障害と血液脳関門(BBB)破壊に関連しています。それにもかかわらず、これら2つの遠い器官の間の接続はまだ決定されていません。胎盤が細胞外小胞を含むシグナル伝達分子を母体循環に放出することを示唆する証拠が増えている。細胞外小胞は、その大きさによって分類され、小さな細胞外小胞(直径200 nm未満のsEV)は、生理学的および病理学的条件の両方で重要なシグナル伝達粒子と見なされます。子癇前症では、母体循環で循環するsEVの数が増加しますが、そのシグナル伝達機能はよくわかっていません。子癇前症または低酸素症に曝露された正常な妊娠胎盤から放出される胎盤sEVは、脳内皮機能障害とBBBの破壊を誘発します。このプロトコルでは、低酸素条件下で培養された胎盤外植片から単離されたsEVが(子癇前症の1つの側面をモデル化)in vivoでBBBを破壊するかどうかを評価します。

Introduction

胎盤形成過程の障害、母体の全身性内皮機能障害を特徴とする高血圧性妊娠症候群である子癇前症による妊産婦死亡の約70%1,2は、急性脳血管合併症と関連しています3,4。妊産婦死亡の大半は低・中所得国で発生している5。しかし、子癇前症に関連する脳血管合併症の臨床的および疫学的関連性にもかかわらず、根底にあるメカニズムはまだ不明です。

一方、細胞外小胞(EV)(直径30~400nm)は、母体と胎盤の相互作用を含む組織や臓器間の細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである6。EVは、外面のタンパク質や脂質に加えて、内部に(タンパク質、RNA、脂質)貨物を運びます。EVは、(1)エクソソーム(直径50~150nm、小型EV(sEV)とも呼ばれる)、(2)中型/大型EV、(3)アポトーシス小体に分類され、サイズ、生合成、内容、潜在的なシグナル伝達機能が異なります。EVの組成は、EVの発生源となる細胞と疾患タイプ7によって決まります。合胞体栄養芽細胞由来のEVは、胎盤アルカリホスファターゼ(PLAP)8,9を発現し、胎盤由来の循環小型EV(PDsEV)を検出します。また、PLAPは、子癇前症と正常血圧妊娠におけるPDsEV貨物の変化とその影響を識別するのに役立ちます10,11,12,13,14,15。

胎盤は、子癇前症16またはこの疾患に関連する脳合併症の病態生理学に必要な成分として認識されています17,18,19。しかし、この遠隔器官が脳循環の変化をどのように誘発するかは不明です。sEVは、ドナー細胞からレシピエント細胞に生理活性成分を転移する能力があるため、細胞間コミュニケーションにおいて極めて重要な役割を果たすため6,20,21、胎盤sEVを脳内皮細胞を含む母体内皮機能障害の生成と関連付ける研究が増えています21,22,23,24 25,26子癇前症の女性。したがって、脳内皮機能の低下は、子癇前症に関連する脳血管合併症の重要な要素である血液脳関門(BBB)の破壊につながる可能性があります3,27。

それにもかかわらず、子癇前症の女性の血清に曝露されたラットの脳血管28または子癇前症の女性の血漿に曝露されたヒト脳内皮細胞29を使用した前臨床所見では、循環因子がBBBの破壊を誘発することが報告されています。子癇前症中に母体循環に存在するBBBに害を及ぼす可能性のあるいくつかの候補があるにもかかわらず、炎症性サイトカイン(すなわち、腫瘍壊死因子)18,28または血管調節因子(すなわち、血管内皮増殖因子(VEGF))29,30,31、または酸化リポタンパク質(oxo-LDL)32,33などの酸化分子34、それらのどれも胎盤とBBBの間の直接的な接続を確立しません。最近、低酸素胎盤から単離されたsEVは、妊娠していない雌マウスのBBBを破壊する能力を示しました25。胎盤sEVは、BBBを破壊する能力を持つリストされた循環因子のほとんどを運ぶ可能性があるため、sEVは、損傷した胎盤を接続し、有害な循環因子のキャリアとなり、子癇前症でBBBを破壊するのに適した候補と考えられています。

このプロトコルにより、低酸素条件下で培養した胎盤外植片から単離されたsEVが、子癇前症中の脳合併症の病態生理学を理解するためのプロキシとして、妊娠していない雌マウスのBBBを破壊できるかどうかを調べることができます。

Protocol

この研究は、ヘルシンキ宣言に明記された原則に従い、それぞれの倫理審査委員会の承認の下で実施されました。以前に報告されたように、すべての人間の参加者は、サンプル収集の前にインフォームドコンセントを行いました25。さらに、ビオビオ大学の生命倫理およびバイオセーフティ委員会は、このプロジェクトを承認しました(Fondecyt助成金1200250)。動物実験は、実験…

Representative Results

このプロトコルは、低酸素状態で培養された胎盤に由来するsEVsが、妊娠していないマウスのBBBを破壊する能力を評価します。この方法により、正常状態と病理学的状態における胎盤と脳の間の潜在的な接続をよりよく理解することができます。特に、この方法は、子癇前症における脳合併症の発症における胎盤sEVの関与を分析するためのプロキシを構成する可能性があります。 <p class="jov…

Discussion

この研究は、低酸素状態で培養した胎盤外植片から分離されたsEVがげっ歯類の血液脳関門の破壊に及ぼす潜在的な害に関する新たな洞察を明らかにしています。病理学的メカニズムは、後脳領域25におけるCLND-5の減少を含む。

以前の研究では、子癇前症の個人からの血漿sEVがさまざまな臓器の内皮機能障害を誘発することが明らかになりました in vitr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、貴重な情報を提供してくれたGRIVAS Healthの研究者に感謝します。また、産婦人科の助産師と臨床スタッフは、チリのチヤン病院に所属しています。Fondecyt Regular 1200250によって設立されました。

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
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Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
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