هنا ، نقدم طريقة لتحديد المركبات التي تعدل آلية ADCC ، وهي آلية مهمة لقتل الخلايا السرطانية للأجسام المضادة للأورام. يتم قياس التأثير السام للخلايا القاتلة الطبيعية في كرويات خلايا سرطان الثدي في وجود تراستوزوماب. يحدد تحليل الصور الخلايا القاتلة والمستهدفة الحية والميتة في الأجسام الكروية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة في نموذج كروي للورم: تطبيق لاكتشاف الأدوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد العلاج المناعي القائم على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الذي يستهدف مستضدات الورم الآن الدعامة الأساسية لعلاج السرطان. إحدى آليات عمل الأجسام المضادة ذات الصلة سريريا هي السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) ، حيث يرتبط الجسم المضاد بالخلايا السرطانية ويشرك المكون الخلوي للجهاز المناعي ، على سبيل المثال ، الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، لقتل الخلايا السرطانية. يمكن تحسين فعالية هذه العلاجات من خلال تحديد المركبات المساعدة التي تزيد من حساسية الخلايا السرطانية أو قوة الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحدد التفاعلات الدوائية غير المكتشفة في مرضى السرطان الذين تم علاجهم بشكل مشترك لحالات سابقة أو الأعراض المرتبطة بالسرطان نجاح العلاج بالأجسام المضادة. لذلك ، يجب القضاء على هذه التفاعلات الدوائية غير المرغوب فيها. مع وضع هذه الأهداف في الاعتبار ، أنشأنا نموذج ADCC للسرطان ووصفنا هنا بروتوكولا بسيطا للعثور على الأدوية المعدلة ل ADCC. نظرا لأن النماذج ثلاثية الأبعاد مثل كرويات الخلايا السرطانية تتفوق على الثقافات ثنائية الأبعاد في التنبؤ بالاستجابات في الجسم الحي للأورام للعلاجات المضادة للسرطان ، فإن الثقافات المشتركة الكروية لخلايا سرطان الثدي HER2 + JIMT-1 التي تعبر عن EGFP و NK92. تم إنشاء خطوط خلايا CD16 وتحفيزها باستخدام Trastuzumab ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة معتمد سريريا ضد سرطان الثدي الإيجابي HER2. سمح للكرويات JIMT-1 بالتشكل في ألواح 96 بئرا طاردة للخلايا. في اليوم 3 ، تمت إضافة الخلايا القاتلة الطبيعية وتراستوزوماب. ثم تم تلطيخ الكرات ب Annexin V-Alexa 647 لقياس موت الخلايا المبرمج ، والذي تم قياسه كميا في المنطقة المحيطية للكرويات باستخدام مجهر آلي. يتم إثبات قابلية تطبيق مقايستنا لتحديد الجزيئات المعدلة ل ADCC من خلال إظهار أن Sunitinib ، وهو مثبط مستقبلات التيروزين كيناز المعتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء ضد السرطان النقيلي ، يلغي ADCC بالكامل تقريبا. يتوافق توليد خطوط أنابيب التقاط الصور وتحليلها مع الفحص عالي الإنتاجية للمركبات المعدلة ل ADCC في كرويات الخلايا السرطانية.
المقدمة
تستخدم كرويات الورم متعددة الخلايا (MCTS) على نطاق واسع نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) تتشكل بسبب ميل الخلايا الملتصقة إلى التجميع وتمثل أداة مهمة لاكتساب نظرة ميكانيكية في بيولوجيا الخلايا السرطانية. يمكن توليدها من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بواسطة العديد من التقنيات ، مثل الثقافات ثلاثية الأبعاد القائمة على السائلوالسقالات 1. ميزتها الرئيسية على نماذج 2D أحادية الطبقة هي أنها تلخص السمات الرئيسية للأورام في الجسم الحي ، وهي التنظيم الهيكلي ونقص الأكسجة ، من خلال محاكاة السلوك البيولوجي للخلايا السرطانية ، وخاصة الآليات التي تؤدي إلى الهروب العلاجي ومقاومة الأدوية2. وبالتالي ، نظرا لأن MCTS يمكن أن يحسن القدرة ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد نموذج كروي للبروتين الفلوري المعزز JIMT-1 (EGFP)
- لتشكيل قاع طارد للخلايا على شكل حرف U ، قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بمحلول 0.5٪ agarose-PBS (30 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة تقريبا.
- اغسل خلايا JIMT-1-EGFP مرتين باستخدام 2 مل من PBS المعقم (تم الإبلاغ عن توليد خط خلايا JIMT1-EGFP في منشور سابق17). استخدم قوارير زراعة الأنسجة T25 ووسائط JIMT-1 (وسط DMEM / F-12 المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 20٪ (FBS) ، و 0.3 وحدة / مل من الأنسولين (100 وحدة دولية / مل ، Humulin R) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين) لزراعة الخلايا.
- أضف 2 مل من التربسين-EDTA إلى القارور....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إنشاء خلايا EGFP التي تعبر عن JIMT-1 ، ونمت كرويات من هذه الخلايا. تم استخدام Sunitinib كمركب اختبار حيث ثبت سابقا أنه يؤثر على مسار ADCC17. سمح للكرويات بالتكتل لمدة 72 ساعة. في اليوم الثالث ، تمت إضافة 10 ميكروغرام / مل من تراستوزوماب (أو متساوي المولى 6.6 ميكروغرام / مل TR-F (ab') 219) والخلايا القاتلة الطبيعية (20: 1) إلى الكرويدات في وجود أو عدم وجود 20 ميكرومتر Sunitinib (1 ساعة قبل المعالجة) ، لفترة إجمالية قدرها 24 ساعة. تم استخدام JIMT-1 وحده و JIMT-1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من التحسينات الكبيرة في علاج BC على مدى العقود العديدة الماضية ، لا يزال المرضى يطورون بانتظام مقاومة الأدوية أو يعانون من آثار جانبية سلبية24. تتطلب معدلات المراضة والوفيات المرتفعة المرتبطة ب BC إجراء تحقيق مستمر في الآليات الجزيئية الأساسية ، تماما مثل منصات الفحص القوية لتحديد جزيئات جديدة قابلة للتنفيذ من أجل التطويرالعلاجي 25. تتطلب هذه الاستراتيجيات مقايسات متعدية قائمة على زراعة الخلايا. ظهرت أنظمة زراعة الورم 3D ، مثل الكروية وعضويات الورم مؤخرا كنماذج من.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تلقت LV تمويلا من منح المكتب الوطني للبحث والتطوير والابتكار GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS "، GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE، OTKA K132193 و K147482. وقد تلقى هذا المشروع تمويلا من شبكة البحوث الهنغارية HUN-REN. تم الحصول على خلايا CD16.176V.NK-92 من الدكتور كيري س. كامبل (مركز فوكس تشيس ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، نيابة عن Brink Biologics، lnc. San Diego، CA) ، محمية ببراءات اختراع في جميع أنحاء العالم ، وتم ترخيصها من قبل Nantkwest، lnc. (www.nantkwest.com). يعرب المؤلفون عن امتنانهم لجيورجي فيرب وأرباد زوور لمساعدتهم في استخدام خط الخلية NK-92 و TR-F (ab') 2 ، وعلى المشورة الفنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 بئر قاع زجاجي خلية حاملة فائقة الصفائح الدقيقة | PerkinElmer ، Waltham ، MA ، USA | LLC | لقياسات الفيريات لوحات |
| زراعة الأنسجة 96 بئر | TPP | 92096 | لبذر الخلايا |
| & alpha ؛ -MEM متوسط | Sigma | M8042 | في NK متوسط |
| Agarose | Sigma | A9539 | لبذر الكرويات |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 مترافق | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | لقياس موت الخلايا المبرمج مع خلايا HCS |
| CD16.176 V.NK-92 | الدكتور كيري س. كامبل (مركز فوكس تشيس للسرطان ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا نيابة عن Brink Biologics، Inc. سان دييغو ، كاليفورنيا) | ATCC CRL-2407 | لزراعة الخلايا |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) | C2110 | لتلوين الخلايا NK |
| DMEM / F-12 متوسط | Sigma | D8437 | في JIMT1-EGFP متوسط |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | Sigma | D8418 | لطلاء لوحة HCS قبل نقل الكرويات |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP و NK متوسط |
| الجلوتامين | جيبكو | 35،050 & ndash ؛ 061 | في NK المتوسطة |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | للتحليل | |
| الإحصائي برنامج Harmony | PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | ل HCA | |
| IL-2 | Proleukin ، Novartis Hung & aacute ؛ ria Kft. ، بودابست ، المجر | PHC0026 | في الأنسولين المتوسط NK |
| (Humulin R) Eli | Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP متوسط |
| JIMT-1 خلايا | لزراعة الخلايا | ||
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM-NEAA) | Gibco | 11،140 &ndash ؛ 050 | في NK المتوسطة |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | في NK |
| متوسطة أوبرا فينيكس معدات تحليل المحتوى | العالي PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة | الأمريكية HH14001000 | ل HCA |
| PBS (محلول ملحي مخزن بوزفات) | Lonza | BE17-517Q | لغسل الخلايا |
| البنسلين الستربتومايسين | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP و NK المتوسطة |
| pLP-1 ، pLP-2 ، pLP-VSV-G ، pWOXEGFP | Invitrogen ، (البروفيسور J & oacute; zsef T zsé ص ، جامعة ديبريسين) | لخط خلايا JIMT-1-EGFP | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | لطلاء لوحة HCS قبل نقل الفيريات |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | للعلاجات |
| Trastuzumab Ab (جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل HER2 متوافق مع البشر) | Herzuma & reg ؛ ، EGIS Pharmaceuticals ، بودابست ، المجر | NDC-63459-303-43 | للعلاجات |
| Trastuzumab-F(ab')2 | هدية من البروفيسور Gy & ouml; rgy Vereb و & Aacute; rpá d Szö r | قسم الفيزياء الحيوية وبيولوجيا الخلية ، جامعة ديبريسين | للعلاجات |
| محلول التريبان الأزرق 0.4٪ | Sigma | T8154 | لعد الخلايا |
| Trypsin-EDTA 1X في PBS | Biosera | LM-T1706 | لانفصال الخلايا |
المراجع
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293(2017).
- Badr-Eldin,....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
