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在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

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DOI：

10.3791/65922

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2024年4月26日

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1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, 4HUN-REN-DE Cell Biology and Signaling Research Group

本文内容

摘要

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。

摘要

基于单克隆抗体的免疫疗法靶向肿瘤抗原现已成为癌症治疗的主要手段。抗体的作用机制之一是抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），即抗体结合癌细胞后，招募免疫系统的细胞组分（如自然杀伤细胞，NK细胞）以杀伤肿瘤细胞。通过鉴定能够增强癌细胞敏感性或提高免疫细胞活性的佐剂化合物，有望提升此类疗法的疗效。此外，癌症患者因既往疾病或癌症相关症状而接受合并用药时，可能产生尚未被发现的药物相互作用，从而影响抗体治疗的效果；因此，需排除此类不良药物相互作用。基于上述目标，我们建立了癌症ADCC模型，并在此描述一种用于筛选ADCC调节药物的简便实验方案。由于三维模型（如肿瘤细胞球状体）在预测方面优于二维培养体系 体内 通过建立表达EGFP的HER2+ JIMT-1乳腺癌细胞与NK92.CD16细胞系的肿瘤球共培养模型，并使用临床批准用于HER2阳性乳腺癌治疗的单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）进行诱导，以评估肿瘤对抗癌治疗的响应。JIMT-1细胞在抗粘附U型底96孔板中培养形成肿瘤球。第3天加入NK细胞和曲妥珠单抗。随后用Annexin V-Alexa 647染色检测细胞凋亡，并利用自动化显微镜定量分析肿瘤球外围区域的凋亡细胞死亡。本实验方法可用于筛选调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的分子，例如证明了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于转移性癌症治疗的受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（Sunitinib）几乎完全抑制ADCC效应。该肿瘤球生成方法及图像采集与分析流程适用于在癌细胞球模型中高通量筛选调节ADCC的化合物。

引言

多细胞肿瘤球体（MCTS）是一种广泛应用的三维（3D）模型，由贴壁细胞因聚集倾向而自发形成，是深入理解癌细胞生物学机制的重要工具。可通过多种技术（如基于液体和基于支架的3D培养方法）从多种细胞类型中生成多细胞肿瘤球体。1与单层二维模型相比，其主要优势在于能够重现 体内 肿瘤的结构组织和缺氧特性，通过模拟肿瘤细胞的生物学行为，尤其是导致治疗逃逸和药物抵抗的机制2因此，由于多细胞肿瘤球体（MCTS）能够提高毒性及药物敏感性的可预测性，它们被广泛用于三维癌症研究，并有望促进针对不同类型癌症的有效药物的开发3.

研究任何疾病都需要相关且便捷的模型。建立癌症免疫学研究模型具有挑战性，因为免疫系统由多种细胞类型组成。每种细胞类型又包含多个亚型以及广泛的活化状态。这些不同的免疫细胞类型与癌细胞及其他肿瘤组分相互作用，最终影响疾病的进程。传统的二维体外（2D in vitro）细胞培养方法无法重现这些复杂的细胞间相互作用，因其缺乏可转化性，且无法在系统层面（例如在组织中）预测药物的作用效果4,5。此外，由于人类与小鼠免疫系统之间存在根本性差异，小鼠模型也具有严重局限性。因此，三维（3D）培养系统可填补现有模型中的空白，提供一种替代方法，从而增进我们对癌症免疫学的理解6。具体而言，类球体模型可用于免疫疗法的测试，主要用于评估药物筛选和治疗性抗体在增强免疫细胞浸润及针对类球体靶标的抗肿瘤效应方面的效率7。此外，由处于不同代谢和增殖状态的细胞组成的多细胞类球体（MCTS）在研究基质细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞）与癌细胞之间的相互作用以及开发新型抗癌策略方面的潜力已得到充分证实8。因此，迫切需要建立具有预测性和准确性的研究平台，以加速药物测试进程，并充分考虑肿瘤微环境的病理生理特征。

乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的癌症。这种异质性疾病的临床分类基于跨膜受体的存在情况，例如雌激素（ER）和孕激素（PR）受体（统称为激素受体，HR），以及人表皮生长因子受体2（HER2）蛋白/癌基因的过表达或扩增。根据这些受体的免疫组化表达情况，通常将其分为四种亚型：腔面A型（HR+/HER2-）、腔面B型（HR+/HER2+）、HER2阳性型（HR-/HER2+）和三阴性乳腺癌（HR-/HER2-）。HER2阳性型约占乳腺癌病例的10%-15%，其特征是HER2高表达且缺乏ER和PR，与腔面型肿瘤相比预后较差，需要使用针对HER2/neu蛋白的特异性药物治疗9。

乳腺癌的发展是一个多步骤的过程，早期诊断对于成功治疗该疾病至关重要10。然而，尽管近年来出现了个性化的乳腺癌治疗方案（例如内分泌治疗和抗HER2抗体治疗），乳腺癌仍然给肿瘤学家带来巨大挑战。与手术、化疗和放疗一样，这些个性化疗法也可能产生严重不良反应，且患者可能对这些药物产生耐药性，这使得确定最佳治疗策略成为一项长期挑战11,12。因此，深入理解肿瘤与其微环境之间的相互作用至关重要，并有望为开发针对不同乳腺癌亚型特异性的新型治疗方法提供新方向13。目前，正在对表达HER2的肿瘤患者广泛人群中研究一系列新型免疫疗法，包括抗体-药物偶联物、过继性T细胞疗法、疫苗以及新型靶向HER2的单克隆抗体（mAbs）14。

例如，曲妥珠单抗（Trastuzumab）是 HER2+ 乳腺癌的一种有效治疗方式。在其作用机制中，曲妥珠单抗介导可结晶片段 γ 受体（FcγR）依赖性活性。FcγR 根据其对 Fc 片段的亲和力以及所启动的免疫反应而有所区分。在自然杀伤（NK）细胞上激活 FcγRIIIa（CD16A）对于介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）至关重要，而在巨噬细胞上激活 FcγRIIa（CD32A）和 FcγRIIIa 则可诱导抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）15。动物模型研究表明，缺乏 FcγRI（CD64）和 FcγRIII（CD16）受体的小鼠无法对肿瘤特异性抗原启动保护性免疫反应，表明 ADCC 很可能是单克隆抗体曲妥珠单抗的主要作用机制之一16。

由于自然杀伤细胞（NK细胞）依赖于结合在肿瘤细胞上的抗体，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤癌细胞，因此Fc受体的表达对于曲妥珠单抗治疗的有效性至关重要17（图1）。此外，NK细胞的功能受到激活性和抑制性受体（例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR））共同调节，从而实现有效平衡18。

ADCC 过程示意图：自然杀伤细胞通过 Fcγ 受体与肿瘤细胞表面抗原相互作用。
图 1．ADCC 在抗肿瘤免疫反应中的作用机制。 自然杀伤（NK）细胞上的 Fcγ 受体识别已结合于癌细胞表面抗原的抗体的 Fc 区域。该免疫突触促使 NK 细胞脱颗粒，释放颗粒酶和穿孔素等细胞毒性介质。这些分子有助于在靶细胞膜上形成孔道，并激活凋亡通路，从而诱导靶细胞发生程序性死亡（图片由 Biorender.com 制作）。 请点击此处查看此图的放大版本。

针对HER2+乳腺癌的免疫治疗研究是一个不断发展的领域。在此过程中，应考虑免疫系统各个组分之间的相互作用。此外，既往已有大量研究广泛测试了包括各类传统疗法、免疫疗法或细胞疗法在内的联合治疗方案，以期发现具有协同效应的组合19。

既往已有多种HER2阳性乳腺癌（HER2+ BC）的三维模型被用于药物发现。例如，Balalaeva等人利用过表达HER2的SKBR-3细胞球，评估了靶向HER2的免疫毒素4D5scFv-PE40的细胞毒性20。在另一项研究中，建立了一种基于Matrigel的HER2阳性乳腺癌三维培养系统，用于检测细胞在曲妥珠单抗和内分泌药物作用下的生长反应21。这些研究凸显了采用过表达HER2的肿瘤细胞所构建的肿瘤细胞球模型，作为有效策略在临床上改善治疗反应的重要性22。

我们课题组先前在二维培养实验中发现，舒尼替尼（Sunitinib）——一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂——可抑制曲妥珠单抗依赖的JIMT-1 HER2+ 乳腺癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。该研究揭示，舒尼替尼可诱导自噬，损害自然杀伤（NK）细胞的杀伤功能，下调HER2表达，并增强JIMT-1细胞的表面黏附能力17。

本研究建立了一种新型的三维球状体ADCC模型（NK.92.CD16+曲妥珠单抗+JIMT-1-EGFP癌细胞），可用于高通量筛选应用；为验证上述发现，选用舒尼替尼作为模型化合物。首先，我们构建了表达EGFP的JIMT-1细胞17，并由这些细胞形成球状体。通过NK细胞联合曲妥珠单抗诱导ADCC效应，球状体在有或无待测化合物的条件下继续培养24小时（图2）。ADCC效应的定量基于高内涵分析系统检测癌细胞的凋亡性死亡（Annexin V染色）。

使用曲妥珠单抗的NK细胞与肿瘤细胞相互作用的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性示意图。
图2．三维球状体共培养系统中的ADCC。 我们的实验设置基于三维球状体系统，与二维模型相比，该系统能更准确地模拟体内微环境。in vivo 微环境。JIMT-1 EGFP乳腺癌细胞被接种在具有抗细胞黏附特性的凹形培养板底部，以形成圆形的细胞聚集体，即球状体。随后通过加入NK92.CD16自然杀伤细胞（效靶比E:T = 20:1）和抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗来启动ADCC反应。该实验模型已被证明在筛选可调节ADCC效应的测试化合物方面具有高效性和良好的可操作性（图像由Biorender.com制作）。 请点击此处查看该图的放大版本。

我们证明了以这种方式获取数据可以在实时条件下完成，并且在癌症药物发现的高内涵筛选中具有统计学稳健性。重要的是，该模型允许对更大规模的化合物进行扩展验证，并可应用于多种感兴趣的检测方法。

方案

1. 建立JIMT-1增强型荧光蛋白（EGFP）球状体模型

  1. 为了形成U形细胞排斥性底部，用0.5%琼脂糖-PBS溶液（每孔30 µL）包被96孔板。在室温下孵育约30-45分钟。
  2. 用2 mL无菌PBS洗涤JIMT-1-EGFP细胞两次（JIMT1-EGFP细胞系的构建已在先前的出版物中报道17）。使用T25组织培养瓶和JIMT-1培养基（DMEM/F-12培养基添加20%胎牛血清（FBS）、0.3 U/mL胰岛素（100 IU/mL，Humulin R）和1%青霉素-链霉素）进行细胞培养。
  3. 向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在CO2培养箱中孵育10分钟。
  4. 轻敲培养瓶，检查JIMT-1细胞在孵育后是否已脱落。
  5. 使用2 mL JIMT-1培养基终止消化，并将细胞悬液收集至15 mL离心管中。
  6. 用0.4%台盼蓝染液（80 µL染液 + 20 µL细胞悬液）在Bürker计数板中计数细胞，并将细胞浓度调整为20,000个细胞/mL。
  7. 将100 µL细胞悬液（每孔2000个细胞）移入96孔板的每个孔中（该板已按步骤1.1所述预先包被0.5%琼脂糖-PBS溶液）。
  8. 将细胞在37 °C的CO2培养箱中孵育3天，使其聚集成团。
  9. 定期使用倒置显微镜检查类球体的大小和形态。

2. HCS 平板的包被

注意：为了防止 JIMT-1-EGFP 类球体附着于培养板的玻璃表面，对高内涵筛选（HCS）板进行包被至关重要（否则将无法进行高内涵分析）。

  1. 在类球体诱导后的第3天，用Pluronic-F127（0.5%溶于DMSO，每孔50 µL）包被96孔高内涵筛选板，并在室温下孵育45分钟。
  2. 吸除包被液，用DMEM/F-12无血清培养基（每孔100 µL）洗涤孔板两次。

3. 类球体转移至高内涵筛选板

  1. 使用 1 mL 移液器，将类球体以每组三个重复的数量转移至玻璃底 96 孔 HCS 板中。

4. 使用测试化合物对 JIMT-1 EGFP 类球体进行预处理

  1. 通过移液向每孔加入10 µL测试化合物（例如，以DMSO稀释至40 µM浓度的舒尼替尼），并向对照（CTL）孔中加入10 µL新鲜JIMT-1培养基。
  2. 将培养板置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育1小时。

5. 通过添加效应细胞诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）

注意：CD16.176V.NK92 细胞（下文简称 NK 细胞）在添加了 20% FBS、1% MEM-NEAA、1% 丙酮酸钠、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 100 IU/mL IL-2 的 α-MEM 培养基中培养。

  1. 将培养瓶中的NK细胞收集至15 mL离心管中。用台盼蓝（80 µL染料 + 20 µL细胞悬液）计数细胞，并将细胞密度调整至效靶比（E:T）为20:1（即每孔40,000个NK细胞）。
  2. 用10 µM细胞追踪蓝染料（CTB，1 µL加入1 mL α-MEM NK培养基中）对NK细胞进行染色，随后置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育1小时。
  3. 将NK细胞在室温下以150 ×g离心3分钟，重复两次，每次用1 mL α-MEM培养基洗涤以去除多余染料。
  4. 将NK细胞沉淀重悬于1 mL新鲜的JIMT-1培养基中。
  5. 通过移液将染色后的NK细胞和抗HER2抗体（Ab）（曲妥珠单抗，溶于无菌蒸馏H2O中）加入靶向JIMT-1类球体中，每孔加入55 µL CTB标记的NK细胞和55 µL含10 µg/mL抗体的JIMT-1培养基（ADCC处理总体积为每孔110 µL，最终舒尼替尼浓度为20 µM）。
    注意：抗体浓度和效靶比的选择依据我们先前发表的研究17。我们进行了预实验，测试了不同效靶比和曲妥珠单抗浓度，以评估在类球体中诱导ADCC的最有效条件（补充图S1）。
  6. 向对照（CTL）孔中每孔加入110 µL新鲜JIMT-1培养基。
  7. 将培养板置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育24小时。
    注意：由于已知NK92细胞具有非特异性细胞毒作用，因此对照组应包括仅与NK细胞共孵育的JIMT-1细胞，以及与同型对照抗体或F(ab')2抗体共孵育的细胞。本实验中使用F(ab')2-曲妥珠单抗（TR-F(ab')2）作为阴性对照。TR-F(ab')2片段的制备方法如Tóth等人19所述，并按照步骤5.5所述与NK细胞一同加入，体积与曲妥珠单抗相同。其浓度调整为6.6 µg/mL，相当于与曲妥珠单抗等摩尔浓度23。

6. 类球体的Annexin V-647染色

  1. 为检测凋亡性细胞死亡，使用JIMT-1培养基按1:100稀释Annexin V-Alexa Fluor 647偶联物，每孔加入50 µL，孵育1小时对类球体进行染色。

7. 成像

注意：在将NK效应细胞加入靶细胞后24小时对培养板进行成像。成像采用高内涵分析仪和图像分析软件。

  1. 使用Plate Type选项从培养板列表中选择微孔板类型。使用96孔高内涵筛选（HCS）板。
  2. 由于实验使用10倍物镜（数值孔径0.3）进行，因此分别通过Autofocus和Objective选项选择双峰自动对焦模式。通过Opt. Mode选项选择共聚焦模式，并通过Binning选项应用2× binning。
  3. 对于类球体成像，使用Channel Selection选项选择合适的荧光通道。检测EGFP转导的JIMT-1细胞时选择EGFP通道（积分时间200 ms，激光功率50%，层厚2.0 µm；激发波长：488 nm，发射波长：500–550 nm）；检测凋亡细胞时使用Alexa 647通道（积分时间100 ms，激光功率50%，层厚10.0 µm；激发波长：640 nm，发射波长：650–760 nm）。为观察类球体内的NK细胞，选择以下通道：DAPI（积分时间100 ms，激光功率50%，层厚2.0 µm；激发波长：405 nm，发射波长：435–480 nm）。
  4. 在Layout Selection选项中选择Z-stack模式，因为类球体中的细胞通常位于显微镜的不同焦平面上。10个焦平面（间距10 µm）足以覆盖整个类球体区域。将第一个和最后一个焦平面的位置分别设置为0 µm和90 µm。
    注意：开始测量前，可使用快照功能拍摄样本图像，以检查设置是否正确。
  5. 使用Define Layout选项设置用于成像的孔数和视野数。

8. 高内涵分析（HCA）

注意：使用 Harmony 软件分析图像，或导出图像以使用首选的第三方软件进行分析。在分析 ADCC 效率时，检测 Annexin V 647 的荧光强度。通过 ADCC 杀死的靶细胞出现在类球体的外周 区域。因此，在该类球体的"环状区域"内测量 Annexin V 阳性细胞。为了验证该方法，采用不同参数进行了分析，以评估哪种参数最可靠且能获得最佳结果（补充图 S2）。视频中展示了一个 ADCC 孔，以逐步演示图像分析过程。

  1. 使用Find Texture Regions选项，通过JIMT-1细胞的EGFP荧光识别球状体，并按大小（> 25,000 µm2）进行筛选。
  2. 通过Select Population 选项去除边缘物体。
  3. 由于Annexin V阳性（凋亡）细胞出现在球状体的外围，因此使用Select Region选项选择凋亡“环”区域（外边界-90%），测量该区域的Annexin信号强度，以确定细胞凋亡程度。
  4. 以平均强度表示Annexin V的信号强度值。

结果

生成了表达EGFP的JIMT-1细胞，并由这些细胞培养出球状体。选用舒尼替尼作为测试化合物，因其先前已被证明可影响ADCC的过程17。球状体允许聚集培养72小时。在第3天，向球状体中加入10 µg/mL曲妥珠单抗（或等摩尔浓度的6.6 µg/mL TR-F(ab')219）和NK细胞（效靶比20:1），同时设置或不设置20 µM舒尼替尼预处理1小时，共作用24小时。单独的JIMT-1细胞以及JIMT-1与NK细胞（效靶比20:1）共孵育组作为CTL对照。球状体用Annexin V 647染色1小时以检测凋亡性细胞死亡，随后使用高内涵分析仪进行成像。

根据Annexin V染色结果，将NK细胞与曲妥珠单抗（Trastuzumab）共同加入JIMT-1细胞后，导致肿瘤类球体发生细胞死亡。Annexin阳性（凋亡）细胞出现在类球体的外周区域，如图3A所示。相比之下，单独加入NK细胞并未引起肿瘤细胞凋亡。为了区分曲妥珠单抗介导ADCC的招募能力与其直接生物学效应，本研究使用缺乏功能性FcR结合能力的TR-F(ab')2作为曲妥珠单抗的阴性对照。由于TR-F(ab')2在此模型中显示无效（图3B），表明该效应可能通过ADCC介导。此外，舒尼替尼（Sunitinib）预处理减少了类球体中的Annexin V染色，证实了舒尼替尼诱导的ADCC耐药性，并揭示了在与NK细胞和曲妥珠单抗共孵育的JIMT-1类球体中，凋亡性细胞死亡受到抑制。

在3D球状体中检测ADCC效应物；凋亡水平的荧光图像和柱状图。
图3．在3D球状体模型中检测ADCC效应化合物。 使用JIMT-1-EGFP细胞生成肿瘤球状体。培养3天后，将球状体转移至已预先包被Pluronic F-127以防止细胞贴壁的HCS板中。次日，在存在或不存在20 µM Sunitinib（SUN）的条件下，向孔中加入10 µg/mL曲妥珠单抗（TR）（或等摩尔浓度的6.6 µg/mL TR-F(ab')2作为阴性对照）以及预先用Cell Tracker Blue染色的NK92.CD16细胞（效应细胞与靶细胞比例为20:1）。单独的JIMT-1球状体以及JIMT-1球状体与NK细胞共培养（20:1）作为对照组。（A）培养24小时后，使用Annexin V 647（红色）对球状体染色1小时，以显示凋亡细胞。（B）每种条件拍摄并分析3个球状体的图像，检测球状体外围区域（环形区域）Annexin V 647的荧光强度。柱状图显示4次独立实验的结果（均值±标准误）。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn's事后检验（*p < 0.05，#p < 0.05，ns：无显著性差异）。请点击此处查看该图的放大版本。

这些数据证实舒尼替尼可抑制抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。预计可通过类似方法鉴定出增强ADCC的化合物。总之，我们的高内涵筛选（HCS）检测法可能适用于筛选影响ADCC的化合物。

补充图 S1. 优化效靶比（E:T）和曲妥珠单抗浓度。 使用 JIMT-1-EGFP 细胞生成球状体。在第 3 天，将球状体转移至高内涵筛选板中，并以不同的效靶比（20:1、40:1 和 60:1）加入自然杀伤细胞（NK 细胞），同时加入 10、20 和 50 µg/mL 的曲妥珠单抗（TR），以确定最能诱导球状体细胞死亡的处理条件。对照组（JIMT-1-EGFP）使用 JIMT-1 细胞培养基处理。(A) 处理 24 小时后，用 Annexin V 647（红色）染色 1 小时，通过高内涵分析（HCA）检测凋亡性细胞死亡。直方图显示三次独立实验结果（均值±标准误）。柱状图表示围绕 JIMT-1 球状体的 Annexin V 647 荧光强度。(B) 分析每种条件下 3 个球状体的环形区域中 Annexin V 647 的荧光强度。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验（*p < 0.05，**p < 0.01，ns：无显著性差异）。请点击此处下载该文件。

补充图 S2. 球状体中 JIMT-1 细胞凋亡的评估。 使用 JIMT-1-EGFP 细胞生成球状体。第 3 天，将球状体转移至 HCS 培养板中，并用 20 µM Sunitinib (SUN) 预处理 1 小时，随后以 20:1 的效靶比加入 NK 细胞，并添加 10 µg/mL 曲妥珠单抗（Trastuzumab）。24 小时后，用 Annexin V 647 染色 1 小时，通过高内涵分析（HCA）检测细胞凋亡。每种条件下分析了 3 个球状体的图像，检测 Annexin V 647 荧光强度（对照组：JIMT-1-EGFP；ADCC 组：20:1 NK 细胞 + 10 µg/mL 曲妥珠单抗；ADCC+SUN 组：20 µM Sunitinib + 20:1 NK 细胞 + 10 µg/mL 曲妥珠单抗）。柱状图表示 Annexin V 647 在 JIMT-1 球状体周围（环状区域）(A)、整个球状体内 (B) 以及整个孔板内 (C) 的荧光强度。直方图显示三次独立实验结果（均值 ± 标准误）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，随后进行 Tukey 事后检验（*p < 0.05，**p < 0.01，ns：无显著性差异）。请点击此处下载该文件。

讨论

尽管在过去几十年中乳腺癌（BC）的治疗取得了显著进展，患者仍经常出现药物耐药性或经历不良副作用24。与乳腺癌相关的高发病率和高死亡率迫切需要持续深入研究其潜在的分子机制，同时也需要建立可靠的筛选平台，以鉴定可用于治疗开发的新分子靶点25。这些研究策略依赖于基于细胞培养的转化实验。近年来，三维肿瘤培养系统（如球状体和肿瘤类器官）作为一种低成本、易于实施的模型逐渐兴起，相较于传统的单层细胞培养，能更真实地模拟肿瘤病理生理的关键特征。其中一项重要特征是多种肿瘤相关免疫细胞与癌细胞之间在空间上协调的相互作用。这使得三维共培养模型成为筛选作用于免疫细胞以治疗恶性肿瘤的药物调节剂的更优工具26。

在本研究中，我们建立了一种新的类球体模型，用于研究自然杀伤细胞（NK细胞）介导的、曲妥珠单抗依赖的针对JIMT-1乳腺癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并描述了一种用于评估NK细胞杀伤癌细胞的自动化成像与分析工作流程。该方法已应用于高内涵成像系统及图像分析软件，可监测NK细胞诱导癌细胞凋亡这一与疾病相关的关键功能。既往在二维细胞培养实验中已发现，多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼可导致JIMT-1细胞对曲妥珠单抗依赖性ADCC产生耐药性。舒尼替尼会损害NK细胞的杀伤功能，并诱导自噬，下调HER2表达，同时增强JIMT-1细胞的黏附能力17。为验证我们所建立的类球体分析流程在化合物筛选中的适用性，我们以舒尼替尼作为模型化合物进行测试，结果表明，该化合物可显著抑制NK细胞对癌细胞类球体的杀伤能力，重现了其在单层培养中的效应。

我们的方法十分简便，包括在经琼脂糖包被的96孔组织培养板中生成球状体，将形成的球状体一次性转移至适用于高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）应用的玻璃底微孔板中，加入待测化合物以及经单独染色并由曲妥珠单抗激活以发挥杀伤作用的自然杀伤细胞（NK细胞），进行一步法细胞死亡染色，最后进行显微镜分析。在两种细胞共培养及药物处理开始后，不再对孔板进行任何剧烈操作，以避免破坏球状体的完整性。该检测仅需4天即可完成。在实验步骤中，使用1%低熔点琼脂糖对96孔组织培养板底部进行包被，是一种比使用超低吸附板更为经济的替代方案，可防止JIMT-1细胞贴附于孔板表面，并促进肿瘤细胞自发形成球状体。由于无法透过琼脂糖垫层和U形塑料表面进行成像，因此需要将球状体转移至成像用孔板中。在转移前，使用生物惰性表面活性剂Pluronic-F127对HCS孔板的玻璃表面进行钝化处理至关重要。若缺少此步骤，球状体会在孔底铺展，导致成像和分析变得困难。

采用稳定表达EGFP的人类肿瘤细胞系用于形成球状体17。这种基因编码的标记物在整个实验流程中可提供持续的荧光信号，无需使用细胞染料。对EGFP信号进行无监督纹理分析，可识别出球状体的致密核心区域，该区域涵盖整个球状体且未诱导细胞死亡。当加入NK细胞并诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）时，球状体轮廓的明显解体有时会给图像分析算法在界定球状体边界时带来挑战。由于Annexin V阳性细胞主要位于球状体的外围区域，因此可通过软件内置的图像分割模块，在明确定义的球状体核心基础上扩展生成一个环形外周区域，从而评估该区域内的细胞死亡情况，以规避上述问题。该区域的外边界扩展因子经过数百个球状体图像的目视筛选后确定，以确保涵盖所有情况下正在死亡、破碎和弥散的细胞边缘区域。通过对Z轴层扫图像最大投影中凋亡环形区域的总荧光强度进行定量，相较于测量整个球状体区域或整个孔板区域，可获得更低的实验误差和更显著的ADCC效应（补充图S2）。荧光标记的选择旨在同时标记乳腺癌细胞（EGFP）并检测细胞死亡（Alexa 647），从而避免多通道分离的需要。实验终点采用荧光标记检测暴露的磷脂酰丝氨酸（一种凋亡标志物）作为读数方式，而非通过监测EGFP荧光强度的下降来随时间评估球状体的存活率，后者也是一种可行方案。Annexin染色能够更准确且灵敏地识别细胞死亡。原则上，可通过引入更多精确的细胞死亡标志物（例如荧光标记的caspase底物）以及明确死亡细胞类型的标记物，进一步优化当前的一维染色方法。

该方法只需进行少量修改，即可用于研究其他效应免疫细胞类型（如巨噬细胞、T细胞以及表达嵌合抗原受体[CAR]的免疫细胞）和激活分子（例如细胞因子、白细胞介素）。为了追求操作的简便性、稳定性和较短的处理时间，我们并未穷尽高内涵筛选（HCA）在此检测中所能提供的所有可能性。成像与分析方案可进一步添加更多的荧光标记。通过加入不同类型的细胞，并使用多重荧光探针以区分这些细胞类型，以及使用特异性荧光标记物将其与正在进行的细胞事件相关联，该检测方法可适用于研究更为复杂的类球体4,5。本方案可适配于任何高内涵成像仪，图像亦可使用任何包含纹理分析模块的图像分析软件进行分析。

本方案的一个关键要点在于使用球状体（spheroids）。因此，必须考虑多个参数。已知与单层培养的细胞相比，三维（3D）培养的细胞对化合物的反应较弱21,22。二维（2D）细胞培养无法 准确预测待测药物在完整生物体内的有效浓度范围。在建立我们的三维模型时，我们测试了高于二维实验中报道的化合物浓度和效靶细胞比（E:T比）。例如，本方案通过将E:T比从我们之前二维ADCC实验中使用的2:117提高至针对癌细胞球状体的20:1，从而实现了优化。这一调整的可能原因是药物难以有效穿透球状体的核心区域，主要作用于外层细胞。另一方面，增加曲妥珠单抗（Trastuzumab）的浓度并未进一步增强ADCC反应（补充图S1）。这种最佳参数的选择可能因细胞系和靶标的不同而有所差异。因此，值得在其他细胞系中测试本方案，例如非HER2阳性乳腺癌细胞系，但需注意HER2表达水平是影响ADCC反应的重要决定因素20。

总之，我们的新方法代表了一种快速且稳健的平台，可用于分析化合物在三维免疫-癌症模型中的作用，具有用于高通量药物筛选的潜力。该方法突显了使用HER2+乳腺癌类球体和NK92.CD16细胞在进一步阐明曲妥珠单抗分子机制方面的重要性，从而为预测曲妥珠单抗依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）在体内的治疗潜力提供了机会in vivo27。寻找新的抗肿瘤免疫调节剂将极大受益于该检测方法。该技术可拓展用于患者来源肿瘤细胞培养物的个体化化疗敏感性测试。我们已证明，传统上用于免疫细胞杀伤和ADCC检测的二维共培养体系可转化为三维类球体检测，从而可能提高其转化相关性。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

LV 获得了匈牙利国家研究、发展与创新办公室资助项目 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS"、GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE、OTKA K132193 和 K147482 的支持。本项目还获得了匈牙利研究网络（HUN-REN）的资助。CD16.176V.NK-92 细胞由 Kerry S. Campbell 博士（费城福克斯蔡斯中心，代表加州圣地亚哥 Brink Biologics, Inc.）提供，该细胞在全球范围内受专利保护，并由 Nantkwest, Inc.（www.nantkwest.com）授权使用。作者感谢 György Vereb 和 Árpád Szöőr 在使用 NK-92 细胞系和 TR-F(ab’)2 以及技术指导方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔玻璃底细胞培养超微孔板PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆LLC 6055302用于类球体测量
96孔组织培养板TPP92096用于细胞接种
α- MEM 培养基SigmaM8042在NK培养基中
琼脂糖SigmaA9539用于球状体接种
Annexin V-Alexa Fluo 647 偶联物Invitrogen-ThermoFisher ScientificA23204用于高内涵筛选的细胞凋亡检测
CD16.176 V.NK-92 细胞Kerry S. Campbell 博士（美国宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心，代表加利福尼亚州圣地亚哥 Brink Biologics 公司）ATCC CRL-2407用于细胞培养
细胞示踪蓝Invitrogen-Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆C2110用于自然杀伤细胞染色
DMEM/F-12 培养基SigmaD8437在 JIMT1-EGFP 培养基中
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD8418用于在转移类球体前包被HCS板
胎牛血清（FBS）BioseraFB-1090/500JIMT-1-EGFP 和 NK 培养基
谷氨酰胺Gibco35,050–061在NK培养基中
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥用于统计分析
Harmony 软件PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆用于HCA
IL-2Proleukin，诺华匈牙利ária Kft.，布达佩斯，匈牙利PHC0026在NK培养基中
胰岛素（Humulin R）Eli LillyHI0219JIMT-1-EGFP 培养基
JIMT-1 乳腺癌细胞用于细胞培养
MEM非必需氨基酸（MEM-NEAA）Gibco11,140–050在NK培养基中
Na-丙酮酸LonzaBE13-115E在NK培养基中
Opera Phenix 高内涵分析设备PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆HH14001000用于HCA
PBS（磷酸盐缓冲盐水）LonzaBE17-517Q用于洗涤细胞
青霉素-链霉素BioseraLM-A4118JIMT-1-EGFP 和 NK 培养基
pLP-1、pLP-2、pLP-VSV-G、pWOXEGFPInvitrogen，（Prof. József T<图片替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" 样式="margin: auto;"/>zsér，德布勒森大学用于JIMT-1-EGFP细胞系
Pluronic-F127SigmaP2443用于在转移类球体前包被HCS板
苹果酸舒尼替尼SigmaAldrichPZ0012用于处理
曲妥珠单抗抗体（人源化抗HER2单克隆抗体）Herzuma®，匈牙利布达佩斯 EGIS 制药公司NDC-63459-303-43用于处理
曲妥珠单抗-F(ab')2Gy教授惠赠örgy Vereb 和 Árpád Szö<图片替代文本"公式 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" 样式="margin: auto;"/>r 德布勒森大学生物物理学与细胞生物学系用于处理
0.4% 台盼蓝溶液SigmaT8154用于细胞计数
PBS中的1X胰蛋白酶-EDTABioseraLM-T1706用于细胞脱离

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NK Annexin V HER2

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