Summary
Saggi chimici rapidi e accurati per lo screening di inibitori specifici sono uno strumento importante nell'arsenale di sviluppo dei farmaci. Qui, presentiamo un saggio chimico scalabile acetil-click per misurare l'inibizione dell'attività di acetilazione di HAT1.
Abstract
HAT1, noto anche come istone acetiltransferasi 1, svolge un ruolo cruciale nella sintesi della cromatina stabilizzando e acetilando l'H4 nascente prima dell'assemblaggio del nucleosoma. È necessario per la crescita del tumore in vari sistemi, il che lo rende un potenziale bersaglio per il trattamento del cancro. Per facilitare l'identificazione di composti in grado di inibire l'attività enzimatica di HAT1, abbiamo ideato un saggio acetil-click per uno screening rapido. In questo semplice saggio, impieghiamo HAT1/Rbap46 ricombinante, che viene purificato da cellule umane attivate. Il metodo utilizza l'analogo dell'acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) in un approccio click-chemistry. Ciò comporta il trasferimento enzimatico di un manico alchino attraverso una reazione di acilazione HAT1-dipendente a un peptide N-terminale H4 biotinilato. Il peptide catturato viene quindi immobilizzato su piastre di neutravidina, seguita da una funzionalizzazione click-chemistry con biotina-azide. Successivamente, il reclutamento della streptavidina-perossidasi viene impiegato per ossidare il rosso amplex, con conseguente emissione fluorescente quantitativa. Introducendo inibitori chimici durante la reazione di acilazione, possiamo quantificare l'inibizione enzimatica in base ad una riduzione del segnale di fluorescenza. È importante sottolineare che questa reazione è scalabile, consentendo lo screening ad alto rendimento di potenziali inibitori per l'attività enzimatica di HAT1.
Introduction
Tra le numerose acetiltransferasi eucariotiche, HAT1 è stata la prima istone acetiltransferasi ad essere isolata 1,2,3. Indagini successive hanno stabilito il suo ruolo fondamentale nella replicazione della cromatina, in particolare nella sintesi di nuovi nucleosomi durante la faseS 4. I nostri sforzi di ricerca hanno portato al riconoscimento che HAT1 è altamente stimolato dal trattamento con fattore di crescita epidermico (EGF) nelle cellule mammarie5. Inoltre, è venuto alla luce che HAT1 è necessario per una rapida proliferazione cellulare e formazione tumorale in vivo 6,7,8,9. I dati indicano che HAT1 è fondamentale nel coordinare i processi anabolici ed epigenetici per la divisione cellulare, guidando la crescita del tumore.
HAT1 di-acetila la coda amino-terminale dell'istone H4 sulle lisine 5 e 12 in complesso con la proteina chaperone Rbap46, che lega l'istone e presenta l'amino-terminale a HAT1. I tetrameri istonici o disomi10, insieme a HAT1/Rbap46 e altri chaperoni istonici11, vengono quindi importati nel nucleo. Gli istoni vengono quindi rilasciati per essere depositati sulla forcella di replicazione o in altri siti per supportare l'attivazione o la repressione genica. La funzione del segno di diacetilazione HAT1 sull'istone H4 non è completamente compresa. È probabile che venga rapidamente rimosso entro un intervallo di 15-30 minuti dall'azione delle deacetilasi istoniche 12,13,14,15 dopo che H4 è stato inserito nella cromatina. Pertanto, il marchio di diacetilazione HAT1 non si propaga nella cromatina e potrebbe non svolgere un vero ruolo epigenetico, sebbene sia stato ipotizzato un ruolo nel reclutamento di enzimi modificanti la cromatina nella cromatina nascente12. Inoltre, HAT1 non acetila direttamente la cromatina; La sua attività è limitata agli istoni solubili.
Lo sviluppo di inibitori dell'acetiltransferasi istonica a piccole molecole è stato ostacolato da saggi aspecifici e a basso rendimento, che spesso hanno portato alla generazione di composti biologicamente reattivi 16,17. Il test gold standard per misurare le attività dell'acetiltransferasi richiede l'uso di 3H-acetil-coA, che limita la produttività e richiede radiazioni. Ciononostante, recentemente sono stati descritti e confermati inibitori specifici e altamente potenti dell'acetiltransferasi a piccole molecole che hanno come bersaglio CBP/p30018 e KAT6A/B19,20 attraverso l'uso di 3H-acetil-CoA. In futuro, si stanno studiando saggi migliorati per ottenere una migliore produttività ed evitare i rischi di laboratorio.
I recenti progressi nel monitoraggio dell'acetilazione21 hanno utilizzato la click chemistry per consentire il monitoraggio delle reazioni enzimatiche. Esiste una varietà di precursori click-enabled che sono accessibili tramite semplici vie sintetiche o disponibili per l'acquisto che possono essere incorporati nelle reazioni enzimatiche. Queste reazioni sono tipicamente condotte in sistemi ricombinanti, sebbene siano possibili anche saggi basati su cellule22. Il vantaggio dei cofattori e dei substrati abilitati al clic è che lo screening può misurare direttamente l'attività enzimatica senza la necessità di sistemi di lettura accoppiati che sono spesso perturbati dai composti di screening e richiedono ulteriori passaggi di manipolazione. Ciò consente trattamenti con inibitori solo durante la fase enzimatica, mentre tutte le fasi di funzionalizzazione e rilevamento a valle vengono eseguite dopo un lavaggio approfondito per rimuovere i composti, limitando così il potenziale di interferenza del saggio. Questi vantaggi rendono la progettazione di saggi click-enabled preferibile ai saggi accoppiati che comunemente si basano sulla rilevazione del coenzima A libero.
Una considerazione importante è l'accettazione di cofattori abilitati al clic nel sito attivo dell'enzima. I cofattori abilitati per i clic esistenti potrebbero non essere completamente compatibili con il sito attivo ottimizzato per il cofattore nativo. Le informazioni strutturali e la modellazione possono essere utilizzate per progettare sostituzioni di amminoacidi per allargare il sito attivo per incorporare substrati alterati23. Ciò può consentire lo screening con una migliore cinetica enzimatica e livelli più bassi di substrato ed enzimi. Lo svantaggio di questo approccio è che le tasche catalitiche alterate potrebbero non identificare gli inibitori che interagiscono fortemente con l'enzima nativo. In definitiva, è necessaria una combinazione di approcci per identificare e convalidare potenziali inibitori enzimatici.
Qui, descriviamo un metodo sviluppato per purificare e saggiare l'attività dell'enzima HAT1 utilizzando il cofattore click 4-penninoil-CoA24. Questo test (Figura 1) utilizza la sequenza enzimatica nativa in complesso con la sua proteina partner richiesta Rbap46, che ha dimostrato di aumentare l'attività enzimatica. La purificazione dell'enzima dalle cellule umane consente l'attivazione enzimatica nella cellulo, che può preservare le stimolanti modificazioni post-traduzionali importanti per la piena attività enzimatica. La progettazione e l'ottimizzazione di saggi enzimatici ricombinanti per schermi chimici ad alto rendimento sono state utilizzate con successo per identificare e caratterizzare gli inibitori delle piccole molecole HAT1.
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Protocol
1. Metodo 1: produzione e purificazione del complesso ricombinante HAT1/Rbap46
- Scongelamento, recupero ed espansione delle cellule HEK293f
- Scongelare 1-10 milioni di cellule di mammifero HEK293f26 in terreni di espressione freestyle 293 da 30 mL in un pallone da 100 mL. Incubare in CO2 all'8% a 37 °C ruotando a 60 giri/min.
- Il giorno successivo, contare e controllare la vitalità delle celle, quindi regolare la velocità di rotazione a 120 giri/min. Espandere la coltura a 300 mL in un matraccio da 1 L, mantenendo la densità di semina a 500.000 cellule/mL e dividendo le cellule prima che la densità superi 3 x 106 cellule/mL.
- Trasfezione HEK293f
- Seminare 5 x 105 cellule/mL in coltura da 300 mL in un matraccio da 1 L e coltivare per 24 ore. Il giorno successivo, contare le cellule per assicurarsi che siano comprese tra 7,5 x 105 e 1,2 x 106 cellule/mL.
- Preparare una miscela di 300 μg di pHEK-FLAG-HAT1 e 300 μg di DNA plasmidico pHEK-Rbap46 in 30 mL di PBS. Aggiungere 1,2 mL di polietilenimmina (PEI) al DNA/PBS e mescolare. Incubare per 20 minuti a RT. Aggiungere la miscela DNA/PBS/PEI alla coltura da 300 mL e incubare a 37 °C per 48 ore a 120 giri/min.
- Cellule di raccolta
- Contare le cellule per assicurarsi che rientrino tra 1,7 x 106 e 2,5 x 106 cellule/mL. A questa densità cellulare, aggiungere forskolina a una concentrazione finale di 12,5 μM per attivare HAT1 e incubare le cellule per 30 minuti, 37 °C, 120 giri/min.
- Pellettare le cellule a 300 x g per 5 minuti, lavare una volta con 30 ml di PBS e congelare in liquido N2 . Conservare a -80 °C fino alla purificazione delle proteine o procedere direttamente alla purificazione.
- Purificazione del complesso FLAG-bead HAT1/Rbap46
- Lisare le cellule e preparare l'estratto proteico.
- Preparare il tampone di lisi aggiungendo una compressa di cocktail di inibitori della proteasi (PIC) a 50 mL di RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2).
- Scongelare il pellet cellulare da 300 mL di coltura su ghiaccio e lisare con 40 mL di tampone di lisi ghiacciato con Triton X-100 allo 0,1%. Sonicare su ghiaccio, quindi centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a 4°C. Raccogli tutto il surnatante in una provetta da 50 ml su ghiaccio, che ora è l'estratto proteico.
- Prepara le perline FLAG.
- Dividere le perle FLAG in quattro provette coniche da 15 mL aggiungendo 400 μL di impasto di perle di agarosio M2-FLAG in ciascuna provetta contenente 5 mL di glicina 0,1 M pH 3,5, 0,01% Triton X-100. Agitare energicamente ogni tubo per 5 secondi a mano.
- Centrifugare a impulsi per 30 s a 1000 x g a 4 °C, aspirare il surnatante, lavare due volte con 5 mL di RSB-500 + 0,1% Triton X-100 (Tx-100; nessun inibitore della proteasi) e incubare su ghiaccio.
- Eseguire l'immunoprecipitazione FLAG.
- Aggiungere 10 ml di estratto proteico a ciascuna provetta conica da 15 ml contenente le perle lavate. Incubare le provette a 4 °C con rotazione invertita per almeno 90 minuti o per tutta la notte.
- Lavare le perline rilegate 5 volte in 10 ml di RSB-500 + 0,1% Tx-100. Per ogni lavaggio, capovolgere il tubo 2x-5x per risospendere le perle, quindi pellet a 1000 x g per 1 min a 4 °C. Infine, lavare 1 volta in RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2) + 0,1% Tx-100.
- Eluizione del peptide FLAG: eluire il complesso HAT1 in 1,5 mL di tampone di eluizione (EB) contenente 0,5 mg/mL di peptide FLAG. Incubare a 4 °C per almeno 1 ora o per tutta la notte. Centrifugare a impulsi le perle eluite a 1000 x g per 30 s a 4 °C e raccogliere il surnatante, che contiene il complesso HAT1/Rbap46 purificato.
- Concentrare le proteine e rimuovere il peptide FLAG.
- Aggiungere l'eluato a un tubo filtrante da 20 mL e 10.000 Dalton. Portare il volume a 15 mL con EB. Centrifugare a 2500 x g per 15 minuti a 4 °C, ripetendo due volte con altri 15 ml di EB ogni volta.
- Recuperare l'eluato finale dal tubo del filtro e controllare la concentrazione proteica con A260. Aspettatevi una concentrazione di 1 mg di proteine totali in 6 mL di EB (per 300 mL di coltura iniziale). Controllare la purezza delle proteine mediante SDS-PAGE, Coomassie e immunoblotting e conservare le aliquote a -80 °C.
- Lisare le cellule e preparare l'estratto proteico.
2. Metodo 2: curva standard HAT1 acetil-click
- Preparazione della curva standard
- Sintetizzare un peptide N-terminale H4 di controllo positivo con la sequenza: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotina)], dove [Pra] indica la Proparglilglicina.
- Sospendere nuovamente il peptide Pra a 0,1 mg/mL in DMSO. Miscelare il peptide Pra con il peptide H4 dell'istone biotinilato (1-23-GGK-biotina) per creare una curva standard (Figura 2; volumi riportati nella Tabella 1). Le curve standard possono essere fatte fresche prima della legatura su piastra o, se fatte in anticipo, miscelate con 20 μL di urea 8 M e conservate a -20 °C fino alla fase 3.3.
3. Metodo 3: test dell'acetil-click HAT1
- Assemblaggio delle reazioni di acetilazione con gli inibitori del test
- Assemblare le reazioni di acetilazione in duplicato in provette PCR da 0,2 mL o piastre PCR a 96 pozzetti dai seguenti componenti: peptide H4 dell'istone biotinilato (1-23-GGK-biotina) risospeso in DMSO a 0,1 mg/mL (34,8 μM), enzima HAT1 pre-diluito in EB, tampone 20x (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), DTT 2 mM, 4-pentinoil-CoA disciolto in acqua a 1 mg/mL (1 mM). Una reazione di 20 μL comprende 10 μL di enzima, 1 μL di peptide H4, 1 μL di tampone 20x, 1 μL di DTT premiscelato e aliquotato ai pozzetti di una piastra PCR a 96 pozzetti su ghiaccio.
- Aggiungere 1 μL di DMSO (controllo negativo) o composto in esame disciolto a 1-10 μM, o H4K12CoA25 (o inibitore del controllo positivo adatto), per pozzetto. Miscelare con pipettaggio delicato e incubare per 10 minuti su ghiaccio per consentire la formazione di complessi enzima-inibitore.
- Continuazione della reazione di acetilazione
- Combinare 2 μL di 4-pentinoil-CoA con 4 μL di acqua, quindi aggiungere ai pozzetti. Miscelare delicatamente mediante pipettaggio, centrifugare a 300 x g per 30 s a RT per raccogliere il contenuto e incubare a 37 °C per 1 h in provette o piastre tappate con pellicola richiudibile.
- Trattare il contenuto direttamente per i prodotti di reazione o temprare con 20 μL di urea 8 M e conservare a -20 °C fino alla lavorazione.
- Legame del peptide alla piastra della neutravidina
- Aggiungere il contenuto della reazione con o senza urea a piastre a 96 pozzetti rivestite di Neutravidina nera pre-bloccata con albumina sierica bovina (BSA) contenenti 80 μL di PBST (PBS + 0,1% Tween-20) per pozzetto.
- Aggiungere peptidi a curva standard in duplicato ai propri pozzetti contenenti 80 μL di PBST. Legare i peptidi con un leggero scuotimento orbitale per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
- Lavaggio: Al termine del legame, aspirare il liquido dai pozzetti e lavare i pozzetti con 200 μL di PBST 3x 15 colpi (volume di corsa 180 μL) utilizzando una rondella per piastre.
- Fare clic sulla reazione chimica
- Preparare i reagenti per la reazione di clic come segue: 100 mM di tris(3-idrossipropiltriazolimetil)ammina (THPTA) ligando in acqua e 20 mM CuSO4 in acqua. Il THPTA previene l'idrolisi catalizzata da Cu(II) e spegne i radicali e i perossidi generati da O2/Cu/ascorbato.
- Aggiungere la miscela THPTA/Cu a 300 mM di ascorbato di sodio in acqua e 2,5 mM di biotina azide in DMSO. La reazione con un clic contiene 140 μL di PBS, 10 μL di THPTA, 10 μL di CuSO4, 10 μL di ascorbato di sodio, 20 μL di biotina-azide. Miscelare sempre i reagenti a scatto freschi, quindi erogare 190 μL in ciascun pozzetto, sigillare la piastra e incubare a 37°C per 1 ora.
- Lavaggio: Aspirare il liquido dai pozzetti e lavare la piastra 3 volte con PBST (volume di corsa di 180 μL, 15 colpi per ogni lavaggio).
- Legame streptavidina-perossidasi di rafano: diluire streptavidina-HRP (0,224 mg/mL) 1:10 in streptavidina (0,224 mg/mL), quindi diluire ulteriormente 1:1000 in PBST. Aggiungere Steptavidin-HRP: miscela di streptavidina (100 μL per pozzetto) e incubare a RT per 1 ora con un leggero agitazione orbitale.
- Lavare 3 volte con PBST come nei passaggi precedenti.
- Ossidazione rossa Amplex
- Combinare i reagenti per la rilevazione del rosso Amplex come segue: 4,45 mL di tampone NaHPO4 (1x = 50 mM di concentrazione finale), 50 μL di amplex rosso (20 mM diluiti in DMSO), 500 μL di H2O2 diluito.
- Diluire H2O2 dal 30% al 3% in 1x tampone NaHPO4 , quindi aggiungere 22,7 μL di H2O2 al 3% in 977 μL di 1x tampone NaHPO4 (questo è l'H2O2 utilizzato per la reazione amplex). Aggiungere 100 μL della miscela di reazione rossa amplex per pozzetto, incubare a RT per 30 minuti al riparo dalla luce, quindi rilevare l'eccitazione/emissione di fluorescenza 571/585 nm utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza standard.
- Calcolo dell'inibizione enzimatica: calcolare l'inibizione percentuale (Figura 3) secondo la seguente formula:
, dove D è il valore di fluorescenza delle reazioni di controllo trattate solo con DMSO, X è il valore delle reazioni trattate con composti in esame e BG è il valore dei pozzetti di fondo (controllo del peptide H4, nessun enzima aggiunto). - Curva di dose: selezionare i composti in esame che inibiscono l'attività dell'enzima HAT1 per saggi ripetuti, con il composto diluito in serie. Determinare empiricamente le diluizioni del composto. Ad esempio, iniziare con una concentrazione di 2 mM, quindi diluire in serie 1:3 per otto diluizioni. Quindi diluire 1:20 in saggi enzimatici che producono una dose massima di 100 μM.
- Rappresentazione grafica della curva: utilizzare la regressione dei minimi quadrati per adattare le curve di inibizione dose-risposta (utilizzando i valori di inibizione percentuale del passaggio 3.10) nel software di analisi dei dati (GraphPad Prism) e derivare i valori IC50 per ciascun composto (Figura 4).
- Reazione di acetilazione con acetil-CoA:
- Usalo per confermare l'attività enzimatica con il cofattore nativo acetil-CoA invece di 4-penninoil-CoA. Eseguire saggi di acetilazione di HAT1 come descritto nei passaggi 3.1-3.2 con acetil-CoA al posto di 4-pentinoil-CoA.
- Individuare i prodotti di reazione su membrane di nitrocellulosa (1-2 μL), lasciarli asciugare, quindi tamponare con anticorpi anti-H4-lisina-12-acetil o anti-H4-lisina-5-acetile. Quantificare il segnale immunoblot mediante densitometria.
, dove D è il valore di fluorescenza delle reazioni di controllo trattate solo con DMSO, X è il valore delle reazioni trattate con composti in esame e BG è il valore dei pozzetti di fondo (controllo del peptide H4, nessun enzima aggiunto).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le curve standard in duplicato (16 pozzetti) devono essere incluse su ogni piastra per garantire una corretta esecuzione del saggio. I dati della curva standard devono essere impostati sotto forma di tabella, con un intervallo compreso tra il 100% e lo 0% in base al rapporto tra il peptide contenente Pra e il peptide H4 nativo in soluzione (Tabella 1). Il segnale rosso di Amplex sarà il più alto nei pozzetti peptidici H4 nativi al 100% pra/0% e il più basso nei pozzetti peptidici H4 nativi allo 0% pra/100%. Dopo che la fluorescenza è stata rilevata e i pozzetti sono stati mediati, il grafico degli standard risultante dovrebbe adattarsi a una linea retta (Figura 2), sebbene sia possibile osservare la saturazione del segnale a concentrazioni superiori al 50% di Pra. La miscelazione impropria di Pra con peptidi di controllo H4 può causare un segnale rosso dell'amplex minimo o nullo o cambiamenti non lineari nel segnale rosso dell'amplex tra lo 0 e il 50% di Pra. I risultati corretti del segnale e della curva indicano che si è verificata la reazione chimica del clic e i dati possono essere analizzati di conseguenza.
È importante includere sempre reazioni di controllo triplicate: le reazioni trattate con DMSO fungono da controlli negativi e le reazioni trattate con H4K12CoA fungono rispettivamente da controlli positivi per l'inibizione enzimatica. Questi dovrebbero essere inclusi su ogni piastra per garantire prestazioni robuste del saggio e consentire calcoli di inibizione percentuale. I pozzetti di controllo positivo che contengono 1 μM di H4K12CoA dovrebbero avere un segnale rosso a basso amplex, simile ai pozzetti peptidici 0% Pra/100% H4. I pozzetti di controllo negativo contenenti DMSO devono avere un segnale simile all'uscita fluorescente dei pozzetti con peptide 50% Pra/50% H4. I pozzetti composti di prova conterranno segnali amplex variabili. Media dei pozzetti duplicati, o triplichi, per ottenere un valore medio del segnale con errore standard.
Calcola l'inibizione enzimatica con la formula sopra dove D è l'uscita fluorescente del DMSO, X è l'uscita sperimentale e BG è l'uscita del peptide H4 senza enzima o il pozzo 0% sulla curva standard. L'output di fluorescenza delle reazioni del composto in esame sarà inferiore a quello del DMSO se il composto in esame inibisce l'attività enzimatica e si tradurrà in valori percentuali di inibizione positivi. L'effetto opposto si vedrà nelle reazioni in cui non si è verificata alcuna inibizione enzimatica. Nella Figura 3 sono illustrati alcuni dati di esempio di composti in esame sottoposti a screening a due concentrazioni (1 μM e 10 μM). Anche le diluizioni seriali dei composti possono essere testate utilizzando questo saggio, in cui l'IC50 del composto può essere trovato con l'adattamento della curva non lineare dei dati (Figura 4).
Figura 1: Schema chimico del click di acetilazione/acilazione di HAT1. La reazione di clic dell'acetilazione HAT1 avviene con le proteine HAT1 e Rbap46 purificate in una soluzione con peptide H4 dell'istone biotinilato, 4-pentinoil-CoA e composti di prova. Dopo che le reazioni sono state completate, la soluzione viene legata a una piastra rivestita di neutravidina e viene completata la chimica del clic con solfato di rame e biotina-azide. L'aggiunta finale di streptavidina-HRP e amplex rosso si traduce in un'emissione fluorescente rossa. Il confronto delle intensità di fluorescenza rossa dell'amplex determina l'attività di acetilazione di HAT1. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Gaddameedi et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di curva standard. Dopo aver calcolato la media dei valori della curva standard per ciascuna coppia, rappresentare graficamente le medie ± SEM rispetto alle percentuali del peptide Pra di controllo positivo. La curva risultante deve essere simile alla curva mostrata e adattarsi a una linea lineare. Questo test ha un limite di rilevazione (LOD) dell'1,8% ± dello 0,89% e un limite di quantificazione (LOQ) del 5,4% ± del 3,1%24. La curva standard può saturarsi per percentuali di Pra >50%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Test di nuovi composti in triplice copia. Il saggio acetil-click è stato utilizzato per valutare l'attività inibitoria dei composti di nuova sintesi. I composti sono stati diluiti a 10 μM e 1 μM per il test in triplice copia, con la mediana indicata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diluizione seriale dei composti in esame nel saggio HAT1 acetyl click. I composti sono stati diluiti da 100 μM a 0,01 μM e testati in doppio. Le curve di dose risultanti mostrano che i composti A e C inibiscono l'attività di HAT1 di quasi il 100% per diverse diluizioni. I dati sono stati poi utilizzati per calcolare l'IC50 dei composti da utilizzare in ulteriori esperimenti. I dati sono medi ± SEM di esperimenti duplicati. I valori di R2 per gli accoppiamenti non lineari sono rispettivamente 0,84, 0,78 e 0,94 per i composti A, B e C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| % Controllo positivo | Peptide di controllo positivo [2,5 rxns] "pra" diluito a 0,1 mg/mL in DMSO (contenente alchini) | Peptide H4 [2,5 rxns] diluito a 0,1 mg/mL in DMSO |
| 100 | 2,5 μL | - |
| 75 | 1,875 μL | 0,625 μL |
| 50 | 1,25 μL | 1,25 μL |
| 25 | 0,625 μL | 1,875 μL |
| 10 | 1 μL | 9 μL |
| 5 | 1,25 μL (di 1:10) | 1,25 μL |
| 1 | 1 μL (di 1:10) | 9 μL |
| 0 | - | 2,5 μL |
| Totale | 8,5 μL | 25,5 μL |
Tabella 1: Diluizione del peptide di controllo Pra al peptide H4. Rapporti tra il peptide "Pra" di controllo positivo e il peptide H4 utilizzati per creare una curva standard. Dopo che il brodo di Pra è stato inizialmente risospeso a 4 mg/mL in DMSO, deve essere diluito 1:40 in DMSO a una concentrazione finale di 0,1 mg/mL. Il peptide H4 biotinilato deve anche essere diluito a 0,1 mg/mL (34,8 μM) in DMSO. Quindi, ogni peptide dovrebbe essere mescolato insieme nelle proporzioni mostrate. Ogni standard verrà aggiunto in duplicato alla piastra a 96 pozzetti. I valori di uscita della fluorescenza devono essere mediati insieme per creare la curva standard.
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Discussion
Nell'ultimo decennio, la click chemistry è diventata importante20, consentendo la progettazione precisa di strutture chimiche interagenti. In questo contesto, varie connessioni covalenti bioortogonali21 sono emerse come opzioni promettenti per la formazione di complessi nel loro ambiente naturale. La chimica dei clic impiega coppie di gruppi funzionali che mostrano reazioni rapide e selettive, comunemente note come "reazioni di clic". Queste reazioni si verificano in modo efficiente in condizioni acquose delicate e rispettose dell'ambiente. In questo articolo, presentiamo lo sviluppo di una piattaforma progettata per identificare e caratterizzare l'attività dell'acetiltransferasiHAT1 24. Questa piattaforma utilizza un test enzimatico ad alto rendimento, basato su peptidi, abilitato dalla chimica a scatto.
Uno dei principali vantaggi di questo test è che si basa sul complesso enzimatico umano HAT1/Rbap46 ottenuto dalla purificazione di cellule umane piuttosto che su una fonte batterica. Inoltre, questo metodo misura direttamente l'attività enzimatica sul substrato peptidico, eliminando la necessità di reazioni accoppiate che potrebbero essere suscettibili di inibizione aspecifica. Sebbene siano disponibili metodi basati su anticorpi per valutare l'attività enzimatica21, il test acetil-click offre vantaggi distinti evitando la variabilità biologica e i costi correlati agli anticorpi. Inoltre, abbiamo convalidato con successo le sue capacità di produzione ad alto rendimento in piastre a 96 pozzetti, rendendo possibile condurre screening chimici estesi. L'approccio click chemistry può probabilmente essere adattato per l'uso anche con altre acetiltransferasi. Ad esempio, le acetiltransferasi ricombinanti potrebbero essere incubate con altri peptidi istonici che imitano i loro substrati naturali in combinazione con 4-pentinoil-CoA per indurre l'acilazione del peptide. Quindi le successive fasi del test per il legame peptidico, la funzionalizzazione e l'ossidazione rossa dell'amplex potrebbero essere rapidamente adattate. È necessario prestare attenzione alla progettazione di controlli positivi e negativi appropriati per le curve standard per consentire la quantificazione del saggio.
È necessario tenere presenti alcune limitazioni del test. Innanzitutto, sebbene questo protocollo sia stato ottimizzato per HAT1, non tutte le acetiltransferasi possono accettare la pentinoil-CoA come mimetico dell'acetil-CoA. Pertanto, lo sviluppo di ulteriori molecole donatrici di acile potrebbe essere preso in considerazione26, o potrebbe essere necessaria la mutagenesi della tasca catalitica per consentire l'accettazione di cofattori compatibili con il clic27,28. In secondo luogo, poiché l'affinità per i cofattori abilitati al clic può differire dal cofattore naturale, si raccomanda di utilizzare test di follow-up secondari per confermare i risultati, ad esempio il rilevamento basato sugli anticorpi (vedere il passaggio 3.12). Infine, devono essere eseguiti ulteriori test enzimatici, biofisici e cellulari di conferma per confermare i risultati. Il legame di piccole molecole a complessi proteici può essere confermato da strumenti che misurano la risonanza plasmonica di superficie, ad esempio29.
Ci sono alcuni passaggi critici da evidenziare per garantire che il test si svolga senza intoppi e che i risultati corrispondenti siano accurati. La crescita esponenziale delle cellule 293f dovrebbe essere evidente prima e dopo la trasfezione del DNA per ottenere una buona espressione proteica. I plasmidi che producono un'elevata espressione proteica in sistemi di trasfezione transitoria dovrebbero essere impiegati, ad esempio il plasmide pHEK-293 utilizzato qui. L'enzima HAT1 è attivato dalla forskolina in questo protocollo, ma risultati simili sono stati ottenuti con l'ortovanadato, suggerendo che sono necessarie modifiche post-traduzionali per l'attività di HAT1. Abbiamo osservato che i preparati enzimatici purificati HAT1/Rbap46 sono relativamente stabili e possono sopravvivere ai cicli di congelamento/scongelamento senza perdita di attività enzimatica. Tuttavia, si consiglia di congelare le aliquote enzimatiche in piccole quantità. In genere non utilizziamo enzimi dopo più di un ciclo di congelamento/disgelo.
Durante il test acetil-click, è importante includere sempre le reazioni di controllo triplicate: le reazioni trattate con DMSO fungono da controlli negativi e le reazioni trattate con H4K12CoA fungono rispettivamente da controlli positivi per l'inibizione enzimatica. I valori di fluorescenza delle reazioni enzimatiche trattate con DMSO dovrebbero rientrare sulla curva standard lineare tra il 25 e il 50 % di peptide Pra positivo per evitare la saturazione del segnale. Ciò può richiedere un'attenta titolazione della quantità di enzima HAT1/Rbap46 nelle reazioni di controllo prima dei test farmacologici. Ad esempio, l'enzima HAT1/Rbap46 può essere diluito 1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:75 e 1:100 in EB, quindi utilizzato nelle reazioni acetil-click per determinare la quantità di enzima necessaria per generare un segnale compreso tra il 25% e il 50% del peptide Pra. Abbiamo scoperto che 100 nM di enzima sono in genere sufficienti, ma dovrebbero essere determinati empiricamente per ogni nuova preparazione di enzima. Lo scopo della miscelazione streptavidina-HRP con streptavidina è quello di diminuire il segnale di ossidazione dell'amplex. La diluizione della streptavidina può essere regolata in base al segnale di uscita secondo necessità. Se viene generato un segnale rapido, potrebbe essere necessario leggere la targa prima di 30 minuti per evitare la saturazione del segnale. Durante l'ottimizzazione iniziale del test, si consiglia di leggere a 5 minuti, 15 minuti e 30 minuti. Le letture seriali possono essere eseguite senza influenzare il segnale. Se il test è ben calibrato, i segnali rossi dell'amplex generati tra 5 min e 30 min dovrebbero scalare linearmente.
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Disclosures
Abbiamo depositato brevetti che descrivono il test acetil-click HAT1 (PCT/US20/29395). J.J.G. riferisce di accordi di consulenza con Sharma Therapeutics, LLC e Guidepoint e di supporto alla ricerca (alla sua istituzione) da parte di Hummingbird Biosciences.
Acknowledgments
Ringraziamo George Zheng per aver fornito H4K12CoA. Ringraziamo i membri del Gruber Lab per le utili discussioni e feedback. Ringraziamo il supporto di NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) e V Foundation (V2022-022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
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