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Artigo de método

Um ensaio químico de acetil-clique para medir a acetilação de histona acetiltransferase 1

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DOI:

10.3791/66054

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26 de janeiro de 2024

 ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine and the Green Center for Reproductive Biology Sciences, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University

Neste artigo

Resumo

Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.

Resumo

HAT1, também conhecido como Histone acetiltransferase 1, desempenha um papel crucial na síntese de cromatina estabilizando e acetilando H4 nascente antes da montagem do nucleossomo. É necessário para o crescimento do tumor em vários sistemas, tornando-se um alvo potencial para o tratamento do câncer. Para facilitar a identificação de compostos que podem inibir a atividade enzimática do HAT1, desenvolvemos um ensaio de acetil-clique para triagem rápida. Neste ensaio simples, empregamos HAT1/Rbap46 recombinante, que é purificado a partir de células humanas ativadas. O método utiliza o análogo 4-pentynoyl-CoA (4P) do acetil-CoA em uma abordagem de química de cliques. Isso envolve a transferência enzimática de uma alça de alcino através de uma reação de acilação dependente de HAT1 para um peptídeo N-terminal H4 biotinilado. O peptídeo capturado é então imobilizado em placas neutravidina, seguido de funcionalização click-química com biotina-azida. Posteriormente, o recrutamento de estreptavidina-peroxidase é empregado para oxidar o vermelho de amplex, resultando em uma produção fluorescente quantitativa. Através da introdução de inibidores químicos durante a reação de acilação, podemos quantificar a inibição enzimática com base na redução do sinal de fluorescência. É importante ressaltar que essa reação é escalável, permitindo a triagem de alto rendimento de potenciais inibidores da atividade enzimática do HAT1.

Introdução

Dentre as numerosas acetiltransferases eucarióticas, a HAT1 foi a histona acetiltransferase inicial a ser isolada 1,2,3. Investigações subsequentes estabeleceram firmemente seu papel fundamental na replicação da cromatina, particularmente na síntese de novos nucleossomos durante a faseS 4. Nossos esforços de pesquisa levaram ao reconhecimento de que o HAT1 é altamente estimulado pelo tratamento com fator de crescimento epidérmico (EGF) em células mamárias5. Além disso, veio à tona que o TAH1 é necessário para a rápida proliferação celular e formação tumoral in vivo6,7,8,9. Os dados indicam que o HAT1 é crítico na coordenação de processos anabólicos e epigenéticos para a divisão celular, impulsionando o crescimento tumoral.

HAT1 di-acetila a cauda amino-terminal da histona H4 nas lisinas 5 e 12 em complexo com a proteína chaperona Rbap46, que se liga à histona e apresenta o amino-terminal ao HAT1. Tetrâmeros de histona ou disomos10, juntamente com HAT1/Rbap46 e outras chaperonas de histonas11, são então importados para o núcleo. As histonas são então liberadas para serem depositadas na bifurcação de replicação ou em outros locais para suportar a ativação ou repressão gênica. A função da marca de di-acetilação HAT1 na histona H4 não é totalmente compreendida. É provável que seja rapidamente removido dentro de um período de 15-30 min pela ação de histonas desacetilases 12,13,14,15 após a inserção de H4 na cromatina. Assim, a marca de di-acetilação HAT1 não é propagada na cromatina e pode não desempenhar um verdadeiro papel epigenético, embora um papel no recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina para a cromatina nascente tenha sido postulado12. Além disso, HAT1 não acetila diretamente a cromatina; sua atividade é restrita a histonas solúveis.

O desenvolvimento de inibidores da acetiltransferase de histonas de pequenas moléculas tem sido dificultado por ensaios inespecíficos e de baixo rendimento, resultando muitas vezes na geração de compostos biologicamente reativos16,17. O ensaio padrão-ouro para medir as atividades da acetiltransferase requer o uso de 3H-acetil-coA, que limita o rendimento e requer radiação. No entanto, recentemente, inibidores específicos e altamente potentes da acetiltransferase de pequenas moléculas visando CBP/p30018 e KAT6A/B19,20 foram descritos e confirmados através do uso de 3H-acetil-CoA. Avançando, ensaios aprimorados para alcançar melhor rendimento e evitar riscos de laboratório estão sendo desenvolvidos.

Avanços recentes no monitoramento da acetilação21 têm utilizado a química de cliques para permitir o monitoramento de reações enzimáticas. Há uma variedade de precursores habilitados por clique que são acessíveis por rotas sintéticas simples ou disponíveis para compra que podem ser incorporados em reações enzimáticas. Essas reações são tipicamente realizadas em sistemas recombinantes, embora ensaios baseados em células também sejam viáveis22. A vantagem dos cofatores e substratos habilitados por clique é que a triagem pode medir diretamente a atividade enzimática sem a necessidade de sistemas de leitura acoplados que são frequentemente perturbados por compostos de triagem e exigem etapas adicionais de manuseio. Isso permite tratamentos com inibidores apenas durante a etapa enzimática, enquanto todas as etapas de funcionalização e detecção a jusante são realizadas após lavagem extensiva para remover compostos, limitando assim o potencial de interferência do ensaio. Essas vantagens tornam o projeto de ensaios habilitados por clique preferível aos ensaios acoplados que geralmente dependem da detecção de coenzima A livre.

Uma consideração importante é a aceitação de cofatores habilitados por clique no sítio ativo da enzima. Os cofatores existentes habilitados para clique podem não ser totalmente compatíveis com o site ativo otimizado para o cofator nativo. Informações estruturais e modelagem podem ser usadas para projetar substituições de aminoácidos para ampliar o sítio ativo e incorporar substratos alterados23. Isso pode permitir a triagem com melhor cinética enzimática e níveis mais baixos de substrato e enzima. A desvantagem dessa abordagem é que bolsas catalíticas alteradas podem não identificar inibidores que interagem fortemente com a enzima nativa. Em última análise, uma combinação de abordagens é necessária para identificar e validar potenciais inibidores enzimáticos.

Aqui, descrevemos um método desenvolvido para purificar e dosar a atividade da enzima HAT1 usando o cofator clique 4-pentynoyl-CoA24. Este ensaio (Figura 1) usa a sequência enzimática nativa em complexo com sua proteína parceira necessária Rbap46, que demonstrou aumentar a atividade enzimática. A purificação da enzima a partir de células humanas permite a ativação enzimática no celulo, o que pode preservar modificações pós-traducionais estimulantes importantes para a plena atividade enzimática. O projeto e a otimização de ensaios enzimáticos recombinantes para telas químicas de alto rendimento têm sido usados com sucesso para identificar e caracterizar inibidores de pequenas moléculas de HAT1.

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Protocolo

1. Método 1: Produção e purificação do complexo recombinante HAT1/Rbap46

  1. Descongelamento, recuperação e expansão de células HEK293f
    1. Descongelar 1-10 milhões de células de mamíferos HEK293f26 em 30 mL de meio de expressão freestyle 293 em um frasco de 100 mL. Incubar em 8% CO2 a 37 °C enquanto gira a 60 rpm.
    2. No dia seguinte, conte e verifique a viabilidade da célula e, em seguida, ajuste a velocidade de rotação para 120 rpm. Expandir para 300 mL de cultura em um frasco de 1 L, mantendo a densidade de semeadura em 500.000 células/mL e dividindo as células antes que a densidade exceda 3 x 106 células/mL.
  2. Transfecção HEK293f
    1. Semente 5 x 105 células/mL em 300 mL de cultura em frasco de 1 L e cultivo por 24 h. No dia seguinte, conte as células para garantir que estejam entre 7,5 x 105 a 1,2 x 106 células/mL.
    2. Preparar uma mistura de 300 μg de pHEK-FLAG-HAT1 e 300 μg de DNAs plasmidiais pHEK-Rbap46 em 30 mL de PBS. Adicionar 1,2 ml de polietilenimina (PEI) ao ADN/PBS e misturar. Incubar por 20 min em RT. Adicionar a mistura DNA/PBS/PEI à cultura de 300 mL e incubar a 37 °C por 48 h a 120 rpm.
  3. Colheita de células
    1. Conte as células para garantir que elas fiquem entre 1,7 x 106 a 2,5 x 106 células/mL. Nesta densidade celular, adicionar forskolina a uma concentração final de 12,5 μM para ativar HAT1 e incubar as células por 30 min, 37 °C, 120 rpm.
    2. Pellet as células a 300 x g por 5 min, lavar uma vez com 30 mL de PBS e congelar rapidamente em líquido N2. Conservar a -80 °C até à purificação das proteínas ou proceder directamente à purificação.
  4. Purificação do complexo HAT1/Rbap46 FLAG-bead
    1. Lise as células e prepare o extrato proteico.
      1. Preparar o tampão de lise adicionando um comprimido de cocktail inibidor de protease (PIC) a 50 ml de RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2).
      2. Descongelar o pellet celular de 300 mL de cultura em gelo e lise com 40 mL de tampão de lise gelada com Triton X-100 a 0,1%. Sonicate no gelo e, em seguida, gire para baixo a 10.000 x g por 10 min a 4°C. Colete todo o sobrenadante em um tubo de 50 mL sobre gelo, que agora é o extrato proteico.
    2. Prepare contas FLAG.
      1. Divida as esferas FLAG em quatro tubos cônicos de 15 mL adicionando 400 μL de polpa de esferas de agarose M2-FLAG em cada tubo contendo 5 mL de 0,1 M de glicina pH 3,5, 0,01% Triton X-100. Agite vigorosamente cada tubo durante 5 s à mão.
      2. Centrifugar por 30 s a 1000 x g a 4 °C, aspirar sobrenadante, lavar duas vezes com 5 mL de RSB-500 + Triton X-100 a 0,1% (Tx-100; sem inibidor de protease) e incubar sobre gelo.
    3. Realizar imunoprecipitação FLAG.
      1. Adicionar 10 mL de extrato proteico a cada 15 mL de tubo cônico contendo contas lavadas. Incubar os tubos a 4 °C com rotação invertida durante pelo menos 90 min ou durante a noite.
      2. Lavar as esferas encadernadas 5x em 10 mL de RSB-500 + Tx-100 0,1%. Para cada lavagem, inverta o tubo 2x-5x para ressuspender as contas e, em seguida, pastilha a 1000 x g por 1 min a 4 °C. Finalmente, lave 1x em RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2) + 0,1% Tx-100.
    4. Eluição do peptídeo FLAG: Eluir o complexo HAT1 em 1,5 mL de tampão de eluição (EB) contendo 0,5 mg/mL de peptídeo FLAG. Incubar a 4 °C durante pelo menos 1 h ou durante a noite. Centrifugar pulsadamente as esferas eluídas a 1000 x g por 30 s a 4 °C e coletar o sobrenadante, que contém o complexo HAT1/Rbap46 purificado.
    5. Concentrar proteína e remover peptídeo FLAG.
      1. Adicionar eluato a um tubo de filtro de corte de 20 mL e 10.000 Dalton. Elevar o volume até 15 mL com EB. Girar a 2500 x g por 15 min a 4 °C, repetindo duas vezes com mais 15 mL de EB de cada vez.
      2. Recupere o eluato final do tubo do filtro e verifique a concentração de proteína por A260. Esperar uma concentração de 1 mg de proteína total em 6 mL de EB (por 300 mL de cultura inicial). Verifique a pureza da proteína por SDS-PAGE, Coomassie e immunoblotting, e armazene alíquotas a -80 °C.

2. Método 2: HAT1 curva padrão acetil-clique

  1. Preparando a curva padrão
    1. Sintetizar um peptídeo N-terminal H4 de controle positivo com a sequência: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotina)], onde [Pra] denota Propargylglycine.
    2. Ressuspender o peptídeo Pra para 0,1 mg/mL em DMSO. Misturar o peptídeo Pra com o peptídeo H4 de histona biotinilada (1-23-GGK-biotina) para criar uma curva padrão (Figura 2; volumes encontrados na Tabela 1). As curvas-padrão podem ser renovadas antes da ligação da placa ou, se feitas antecipadamente, misturadas com 20 μL de ureia 8 M e armazenadas a -20 °C até ao passo 3.3.

3. Método 3: HAT1 ensaio acetil-clique

  1. Montagem de reações de acetilação com inibidores de teste
    1. Montar reações de acetilação em duplicata em tubos de PCR de 0,2 mL ou placas de PCR de 96 poços a partir dos seguintes componentes: peptídeo H4 de histona biotinilado (1-23-GGK-biotina) ressuspendido em DMSO a 0,1 mg/mL (34,8 μM), enzima HAT1 pré-diluída em EB, tampão 20x (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), 2 mM de TDT, 4-pentinoil-CoA dissolvido em água a 1 mg/mL (1 mM). Uma reação de 20 μL compreende 10 μL de enzima, 1 μL de peptídeo H4, 1 μL de tampão 20x, 1 μL de TDT pré-misturado e aliquotado a poços de uma placa de PCR de 96 poços sobre gelo.
    2. Adicionar 1 μL de DMSO (controlo negativo) ou composto de ensaio dissolvido a 1-10 μM, ou H4K12CoA25 (ou inibidor de controlo positivo adequado), por poço. Misture por pipetagem suave e incube por 10 min no gelo para permitir a formação de complexos enzimáticos: inibidores.
  2. Continuação da reação de acetilação
    1. Combinar 2 μL de 4-pentinoil-CoA com 4 μL de água e, em seguida, adicionar aos poços. Misturar suavemente por pipetagem, centrifugar a 300 x g durante 30 s em RT para recolher o conteúdo e incubar a 37 °C durante 1 h em tubos tampados ou placas com folha reselável.
    2. Processar o conteúdo diretamente para produtos de reação ou extinguir com 20 μL de ureia 8 M e armazenar a -20 °C até o processamento.
  3. Ligação de peptídeos à placa de Neutravidin
    1. Adicionar o conteúdo da reação com ou sem ureia às placas de 96 poços pré-bloqueadas de albumina de soro bovino (BSA) pretas revestidas com neutravidina contendo 80 μL de PBST (PBS + 0,1% Tween-20) por poço.
    2. Adicionar peptídeos de curva padrão em duplicata aos seus próprios poços contendo 80 μL de PBST. Ligar peptídeos com agitação orbital suave por 1 h à temperatura ambiente (TR).
  4. Lavagem: Após a ligação completa, aspirar o líquido dos poços e lavá-los com 200 μL de PBST 3x 15 tempos (volume sistólico de 180 μL) usando uma lavadora de placas.
  5. Clique em reação química
    1. Preparar os reagentes para a reação de clique da seguinte forma: 100 mM Tris(3-hidroxipropiltriazolimetil)amina (THPTA) ligante em água e 20 mM CuSO4 em água. THPTA previne a hidrólise catalisada por(II) e elimina radicais e peróxidos gerados a partir de O2//ascorbato.
    2. Adicionar a mistura THPTA/a 300 mM de ascorbato de sódio em água e 2,5 mM de azida de biotina em DMSO. A reação de um clique contém 140 μL de PBS, 10 μL de THPTA, 10 μL de CuSO4, 10 μL de ascorbato de sódio, 20 μL de biotina-azida. Misture sempre os reagentes de clique frescos, depois distribua 190 μL em cada poço, sele a placa e incube a 37°C por 1 h.
  6. Lavagem: Aspirar o líquido dos poços e lavar a placa 3x com PBST (volume sistólico de 180 μL, 15 tempos para cada lavagem).
  7. Ligação estreptavidina-peroxidase de rábano forte: Diluir estreptavidina-HRP (0,224 mg/mL) 1:10 em estreptavidina (0,224 mg/mL), diluir 1:1000 em PBST. Adicionar Steptavidin-HRP: mistura de estreptavidina (100 μL por poço) e incubar em RT por 1 h com agitação orbital suave.
  8. Lave 3x com PBST como nas etapas anteriores.
  9. Oxidação vermelha de Amplex
    1. Combinar os reagentes de detecção Amplex red da seguinte forma: 4,45 mL de tampão NaHPO4 (concentração final 1x = 50 mM), 50 μL de vermelho de amplex (20 mM diluído em DMSO), 500 μL de H2O2 diluído.
    2. Diluir H2O2 de 30% de estoque para 3% em 1x tampão NaHPO4 e, em seguida, adicionar 22,7 μL de 3% H2O2 em 977 μL de 1x tampão NaHPO4 (este é o H2O2 usado para a reação amplex). Adicionar 100 μL da mistura de reação vermelha de amplex por poço, incubar em RT por 30 min protegido da luz e, em seguida, detectar a excitação/emissão de fluorescência 571/585 nm usando um leitor de placa de fluorescência padrão.
  10. Cálculo da inibição enzimática: Calcular a porcentagem de inibição (Figura 3) de acordo com a seguinte fórmula: figure-protocol-1, onde D é o valor de fluorescência das reações de controle tratadas apenas com DMSO, X é o valor das reações tratadas com compostos de teste e BG é o valor dos poços de fundo (controle do peptídeo H4, sem adição de enzima).
  11. Curva de dose: Selecione os compostos de teste que inibem a atividade da enzima HAT1 para ensaios repetidos, com o composto diluído em série. Determinar empiricamente as diluições do composto. Por exemplo, comece com 2 mM de concentração de estoque e, em seguida, dilua em série 1:3 para oito diluições. Em seguida, diluir 1:20 em ensaios enzimáticos produzindo 100 μM de dose máxima.
    1. Plotagem da curva: Use a regressão de mínimos quadrados para ajustar as curvas de inibição dose-resposta (usando valores de inibição percentual do passo 3.10) no software de análise de dados (GraphPad Prism) e derive os valores de IC50 para cada composto (Figura 4).
  12. Reação de acetilação com acetil-CoA:
    1. Use isso para confirmar a atividade enzimática com o cofator nativo acetil-CoA em vez de 4-pentinoil-CoA. Realizar ensaios de acetilação HAT1 conforme descrito nas etapas 3.1-3.2 com acetil-CoA no lugar de 4-pentinoil-CoA.
    2. Identifique os produtos da reação em membranas de nitrocelulose (1-2 μL), deixe-os secar e, em seguida, dot-blot com anticorpos anti-H4-lisina-12-acetil ou anti-H4-lisina-5-acetil. Quantificar o sinal do immunoblot por densitometria.

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Resultados

Curvas padrão em duplicata (16 poços) devem ser incluídas em cada placa para garantir o desempenho adequado do ensaio. Os dados da curva padrão devem ser estabelecidos em forma de tabela, com um intervalo de 100% a 0% de acordo com a proporção de peptídeo contendo Pra para peptídeo H4 nativo em solução (Tabela 1). O sinal vermelho de Amplex será o mais alto em poços de peptídeo H4 nativo de 100% pra/0% e o mais baixo em poços de peptídeo H4 nativo de 0% pra/100%. Após a fluorescência ter sido detectada e...

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Discussão

Na última década, a química de cliques tornou-se proeminente20, permitindo o projeto preciso de estruturas químicas interagentes. Dentro deste contexto, várias conexões covalentes bioortogonais21 têm emergido como opções promissoras para a formação de complexos em seu ambiente natural. A química de cliques emprega pares de grupos funcionais que exibem reações rápidas e seletivas, comumente conhecidas como "reações de clique". Estas reações ocorrem eficientemente em condiçõe...

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Divulgações

Registramos patentes descrevendo o ensaio HAT1 acetil-clique (PCT/US20/29395). J.J.G. relata acordos de consultoria com Sharma Therapeutics, LLC e Guidepoint e apoio à pesquisa (para sua instituição) da Hummingbird Biosciences.

Agradecimentos

Agradecemos a George Zheng por fornecer H4K12CoA. Agradecemos aos membros do Gruber Lab pelas discussões e comentários úteis. Agradecemos o apoio do NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) e da V Foundation (V2022-022).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4P CoACayman Chemical10547Co-fator químico Click
Amplex RedFisher SciA12222Substrato de fluorescência
Biotina-PEG-AzidaAlfa AesarJ64996MCQuímica Click
Sulfatode cobre Sigma-aldrich  7758-98-7Química de clique
DMSOFisher Scientific  67-68-5diluente
DTTAcros Organics03-12-3483agente redutor
ForskolinVWR102987-310Expressão de proteína
Freestyle 293 Meio de expressãoThermo Fisher12338018Media
Freestyle 293-F célulasThermo FisherR790-07Expressão de proteína
H4-peptídeo / 1-23-GGK-biotinaAnaspecpeptídicode AS65097
HEPESSigma-aldrich  7365-45-9Tampão EB
Solução de peróxido de hidrogênio a 30%Sigma-aldrich  Z00183-99-0iniciador
M2 FLAG pasta de anticorposMillipore-SigmaA2220Purificação de proteínas
Filtro Macrosep 10K (Pall Lab)VWR89131-980Purificação de proteínas
Placa de neutravidinaThermo Sci15127NP40 pré-bloqueado por BSA
(IGEPAL)MP Biomedical19859620x
tampão pHEK-293 plasmídeoTakara Bio3390Expressão de
proteína tamponada com fosfato salino 10xAlfa Aesar  Z00082-33-6tampão de lavagem
Peptídeo PraGenscriptSíntese personalizadabiotinilada
Ascorbato de SódioSigma-aldrich  134-03-2Clique em química
Cloreto desódio Sigma-aldrich  7647-14-5Tampão EB
Fosfato de sódioVWR International7558-80-7Tampão
EstreptavidinaEMD Millipore189730concorrente
Streptavidin-HRPCell Signaling3999Senzima
THPTA liganteFisher Sci1010-500Clique em química
Base TrisSigma-aldrich  77-86-120x buffer
Triton-X 100VWR International  9002-93-1Buffer EB
Tween-20Sigma-aldrich  9005-64-5Tampão de lavagem
UreiaSigma-Aldrich57-13-6quencher
substrato

Referências

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