Summary
Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.
Abstract
HAT1, também conhecido como Histone acetiltransferase 1, desempenha um papel crucial na síntese de cromatina estabilizando e acetilando H4 nascente antes da montagem do nucleossomo. É necessário para o crescimento do tumor em vários sistemas, tornando-se um alvo potencial para o tratamento do câncer. Para facilitar a identificação de compostos que podem inibir a atividade enzimática do HAT1, desenvolvemos um ensaio de acetil-clique para triagem rápida. Neste ensaio simples, empregamos HAT1/Rbap46 recombinante, que é purificado a partir de células humanas ativadas. O método utiliza o análogo 4-pentynoyl-CoA (4P) do acetil-CoA em uma abordagem de química de cliques. Isso envolve a transferência enzimática de uma alça de alcino através de uma reação de acilação dependente de HAT1 para um peptídeo N-terminal H4 biotinilado. O peptídeo capturado é então imobilizado em placas neutravidina, seguido de funcionalização click-química com biotina-azida. Posteriormente, o recrutamento de estreptavidina-peroxidase é empregado para oxidar o vermelho de amplex, resultando em uma produção fluorescente quantitativa. Através da introdução de inibidores químicos durante a reação de acilação, podemos quantificar a inibição enzimática com base na redução do sinal de fluorescência. É importante ressaltar que essa reação é escalável, permitindo a triagem de alto rendimento de potenciais inibidores da atividade enzimática do HAT1.
Introduction
Dentre as numerosas acetiltransferases eucarióticas, a HAT1 foi a histona acetiltransferase inicial a ser isolada 1,2,3. Investigações subsequentes estabeleceram firmemente seu papel fundamental na replicação da cromatina, particularmente na síntese de novos nucleossomos durante a faseS 4. Nossos esforços de pesquisa levaram ao reconhecimento de que o HAT1 é altamente estimulado pelo tratamento com fator de crescimento epidérmico (EGF) em células mamárias5. Além disso, veio à tona que o TAH1 é necessário para a rápida proliferação celular e formação tumoral in vivo6,7,8,9. Os dados indicam que o HAT1 é crítico na coordenação de processos anabólicos e epigenéticos para a divisão celular, impulsionando o crescimento tumoral.
HAT1 di-acetila a cauda amino-terminal da histona H4 nas lisinas 5 e 12 em complexo com a proteína chaperona Rbap46, que se liga à histona e apresenta o amino-terminal ao HAT1. Tetrâmeros de histona ou disomos10, juntamente com HAT1/Rbap46 e outras chaperonas de histonas11, são então importados para o núcleo. As histonas são então liberadas para serem depositadas na bifurcação de replicação ou em outros locais para suportar a ativação ou repressão gênica. A função da marca de di-acetilação HAT1 na histona H4 não é totalmente compreendida. É provável que seja rapidamente removido dentro de um período de 15-30 min pela ação de histonas desacetilases 12,13,14,15 após a inserção de H4 na cromatina. Assim, a marca de di-acetilação HAT1 não é propagada na cromatina e pode não desempenhar um verdadeiro papel epigenético, embora um papel no recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina para a cromatina nascente tenha sido postulado12. Além disso, HAT1 não acetila diretamente a cromatina; sua atividade é restrita a histonas solúveis.
O desenvolvimento de inibidores da acetiltransferase de histonas de pequenas moléculas tem sido dificultado por ensaios inespecíficos e de baixo rendimento, resultando muitas vezes na geração de compostos biologicamente reativos16,17. O ensaio padrão-ouro para medir as atividades da acetiltransferase requer o uso de 3H-acetil-coA, que limita o rendimento e requer radiação. No entanto, recentemente, inibidores específicos e altamente potentes da acetiltransferase de pequenas moléculas visando CBP/p30018 e KAT6A/B19,20 foram descritos e confirmados através do uso de 3H-acetil-CoA. Avançando, ensaios aprimorados para alcançar melhor rendimento e evitar riscos de laboratório estão sendo desenvolvidos.
Avanços recentes no monitoramento da acetilação21 têm utilizado a química de cliques para permitir o monitoramento de reações enzimáticas. Há uma variedade de precursores habilitados por clique que são acessíveis por rotas sintéticas simples ou disponíveis para compra que podem ser incorporados em reações enzimáticas. Essas reações são tipicamente realizadas em sistemas recombinantes, embora ensaios baseados em células também sejam viáveis22. A vantagem dos cofatores e substratos habilitados por clique é que a triagem pode medir diretamente a atividade enzimática sem a necessidade de sistemas de leitura acoplados que são frequentemente perturbados por compostos de triagem e exigem etapas adicionais de manuseio. Isso permite tratamentos com inibidores apenas durante a etapa enzimática, enquanto todas as etapas de funcionalização e detecção a jusante são realizadas após lavagem extensiva para remover compostos, limitando assim o potencial de interferência do ensaio. Essas vantagens tornam o projeto de ensaios habilitados por clique preferível aos ensaios acoplados que geralmente dependem da detecção de coenzima A livre.
Uma consideração importante é a aceitação de cofatores habilitados por clique no sítio ativo da enzima. Os cofatores existentes habilitados para clique podem não ser totalmente compatíveis com o site ativo otimizado para o cofator nativo. Informações estruturais e modelagem podem ser usadas para projetar substituições de aminoácidos para ampliar o sítio ativo e incorporar substratos alterados23. Isso pode permitir a triagem com melhor cinética enzimática e níveis mais baixos de substrato e enzima. A desvantagem dessa abordagem é que bolsas catalíticas alteradas podem não identificar inibidores que interagem fortemente com a enzima nativa. Em última análise, uma combinação de abordagens é necessária para identificar e validar potenciais inibidores enzimáticos.
Aqui, descrevemos um método desenvolvido para purificar e dosar a atividade da enzima HAT1 usando o cofator clique 4-pentynoyl-CoA24. Este ensaio (Figura 1) usa a sequência enzimática nativa em complexo com sua proteína parceira necessária Rbap46, que demonstrou aumentar a atividade enzimática. A purificação da enzima a partir de células humanas permite a ativação enzimática no celulo, o que pode preservar modificações pós-traducionais estimulantes importantes para a plena atividade enzimática. O projeto e a otimização de ensaios enzimáticos recombinantes para telas químicas de alto rendimento têm sido usados com sucesso para identificar e caracterizar inibidores de pequenas moléculas de HAT1.
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Protocol
1. Método 1: Produção e purificação do complexo recombinante HAT1/Rbap46
- Descongelamento, recuperação e expansão de células HEK293f
- Descongelar 1-10 milhões de células de mamíferos HEK293f26 em 30 mL de meio de expressão freestyle 293 em um frasco de 100 mL. Incubar em 8% CO2 a 37 °C enquanto gira a 60 rpm.
- No dia seguinte, conte e verifique a viabilidade da célula e, em seguida, ajuste a velocidade de rotação para 120 rpm. Expandir para 300 mL de cultura em um frasco de 1 L, mantendo a densidade de semeadura em 500.000 células/mL e dividindo as células antes que a densidade exceda 3 x 106 células/mL.
- Transfecção HEK293f
- Semente 5 x 105 células/mL em 300 mL de cultura em frasco de 1 L e cultivo por 24 h. No dia seguinte, conte as células para garantir que estejam entre 7,5 x 105 a 1,2 x 106 células/mL.
- Preparar uma mistura de 300 μg de pHEK-FLAG-HAT1 e 300 μg de DNAs plasmidiais pHEK-Rbap46 em 30 mL de PBS. Adicionar 1,2 ml de polietilenimina (PEI) ao ADN/PBS e misturar. Incubar por 20 min em RT. Adicionar a mistura DNA/PBS/PEI à cultura de 300 mL e incubar a 37 °C por 48 h a 120 rpm.
- Colheita de células
- Conte as células para garantir que elas fiquem entre 1,7 x 106 a 2,5 x 106 células/mL. Nesta densidade celular, adicionar forskolina a uma concentração final de 12,5 μM para ativar HAT1 e incubar as células por 30 min, 37 °C, 120 rpm.
- Pellet as células a 300 x g por 5 min, lavar uma vez com 30 mL de PBS e congelar rapidamente em líquido N2. Conservar a -80 °C até à purificação das proteínas ou proceder directamente à purificação.
- Purificação do complexo HAT1/Rbap46 FLAG-bead
- Lise as células e prepare o extrato proteico.
- Preparar o tampão de lise adicionando um comprimido de cocktail inibidor de protease (PIC) a 50 ml de RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2).
- Descongelar o pellet celular de 300 mL de cultura em gelo e lise com 40 mL de tampão de lise gelada com Triton X-100 a 0,1%. Sonicate no gelo e, em seguida, gire para baixo a 10.000 x g por 10 min a 4°C. Colete todo o sobrenadante em um tubo de 50 mL sobre gelo, que agora é o extrato proteico.
- Prepare contas FLAG.
- Divida as esferas FLAG em quatro tubos cônicos de 15 mL adicionando 400 μL de polpa de esferas de agarose M2-FLAG em cada tubo contendo 5 mL de 0,1 M de glicina pH 3,5, 0,01% Triton X-100. Agite vigorosamente cada tubo durante 5 s à mão.
- Centrifugar por 30 s a 1000 x g a 4 °C, aspirar sobrenadante, lavar duas vezes com 5 mL de RSB-500 + Triton X-100 a 0,1% (Tx-100; sem inibidor de protease) e incubar sobre gelo.
- Realizar imunoprecipitação FLAG.
- Adicionar 10 mL de extrato proteico a cada 15 mL de tubo cônico contendo contas lavadas. Incubar os tubos a 4 °C com rotação invertida durante pelo menos 90 min ou durante a noite.
- Lavar as esferas encadernadas 5x em 10 mL de RSB-500 + Tx-100 0,1%. Para cada lavagem, inverta o tubo 2x-5x para ressuspender as contas e, em seguida, pastilha a 1000 x g por 1 min a 4 °C. Finalmente, lave 1x em RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2) + 0,1% Tx-100.
- Eluição do peptídeo FLAG: Eluir o complexo HAT1 em 1,5 mL de tampão de eluição (EB) contendo 0,5 mg/mL de peptídeo FLAG. Incubar a 4 °C durante pelo menos 1 h ou durante a noite. Centrifugar pulsadamente as esferas eluídas a 1000 x g por 30 s a 4 °C e coletar o sobrenadante, que contém o complexo HAT1/Rbap46 purificado.
- Concentrar proteína e remover peptídeo FLAG.
- Adicionar eluato a um tubo de filtro de corte de 20 mL e 10.000 Dalton. Elevar o volume até 15 mL com EB. Girar a 2500 x g por 15 min a 4 °C, repetindo duas vezes com mais 15 mL de EB de cada vez.
- Recupere o eluato final do tubo do filtro e verifique a concentração de proteína por A260. Esperar uma concentração de 1 mg de proteína total em 6 mL de EB (por 300 mL de cultura inicial). Verifique a pureza da proteína por SDS-PAGE, Coomassie e immunoblotting, e armazene alíquotas a -80 °C.
- Lise as células e prepare o extrato proteico.
2. Método 2: HAT1 curva padrão acetil-clique
- Preparando a curva padrão
- Sintetizar um peptídeo N-terminal H4 de controle positivo com a sequência: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotina)], onde [Pra] denota Propargylglycine.
- Ressuspender o peptídeo Pra para 0,1 mg/mL em DMSO. Misturar o peptídeo Pra com o peptídeo H4 de histona biotinilada (1-23-GGK-biotina) para criar uma curva padrão (Figura 2; volumes encontrados na Tabela 1). As curvas-padrão podem ser renovadas antes da ligação da placa ou, se feitas antecipadamente, misturadas com 20 μL de ureia 8 M e armazenadas a -20 °C até ao passo 3.3.
3. Método 3: HAT1 ensaio acetil-clique
- Montagem de reações de acetilação com inibidores de teste
- Montar reações de acetilação em duplicata em tubos de PCR de 0,2 mL ou placas de PCR de 96 poços a partir dos seguintes componentes: peptídeo H4 de histona biotinilado (1-23-GGK-biotina) ressuspendido em DMSO a 0,1 mg/mL (34,8 μM), enzima HAT1 pré-diluída em EB, tampão 20x (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), 2 mM de TDT, 4-pentinoil-CoA dissolvido em água a 1 mg/mL (1 mM). Uma reação de 20 μL compreende 10 μL de enzima, 1 μL de peptídeo H4, 1 μL de tampão 20x, 1 μL de TDT pré-misturado e aliquotado a poços de uma placa de PCR de 96 poços sobre gelo.
- Adicionar 1 μL de DMSO (controlo negativo) ou composto de ensaio dissolvido a 1-10 μM, ou H4K12CoA25 (ou inibidor de controlo positivo adequado), por poço. Misture por pipetagem suave e incube por 10 min no gelo para permitir a formação de complexos enzimáticos: inibidores.
- Continuação da reação de acetilação
- Combinar 2 μL de 4-pentinoil-CoA com 4 μL de água e, em seguida, adicionar aos poços. Misturar suavemente por pipetagem, centrifugar a 300 x g durante 30 s em RT para recolher o conteúdo e incubar a 37 °C durante 1 h em tubos tampados ou placas com folha reselável.
- Processar o conteúdo diretamente para produtos de reação ou extinguir com 20 μL de ureia 8 M e armazenar a -20 °C até o processamento.
- Ligação de peptídeos à placa de Neutravidin
- Adicionar o conteúdo da reação com ou sem ureia às placas de 96 poços pré-bloqueadas de albumina de soro bovino (BSA) pretas revestidas com neutravidina contendo 80 μL de PBST (PBS + 0,1% Tween-20) por poço.
- Adicionar peptídeos de curva padrão em duplicata aos seus próprios poços contendo 80 μL de PBST. Ligar peptídeos com agitação orbital suave por 1 h à temperatura ambiente (TR).
- Lavagem: Após a ligação completa, aspirar o líquido dos poços e lavá-los com 200 μL de PBST 3x 15 tempos (volume sistólico de 180 μL) usando uma lavadora de placas.
- Clique em reação química
- Preparar os reagentes para a reação de clique da seguinte forma: 100 mM Tris(3-hidroxipropiltriazolimetil)amina (THPTA) ligante em água e 20 mM CuSO4 em água. THPTA previne a hidrólise catalisada por(II) e elimina radicais e peróxidos gerados a partir de O2//ascorbato.
- Adicionar a mistura THPTA/a 300 mM de ascorbato de sódio em água e 2,5 mM de azida de biotina em DMSO. A reação de um clique contém 140 μL de PBS, 10 μL de THPTA, 10 μL de CuSO4, 10 μL de ascorbato de sódio, 20 μL de biotina-azida. Misture sempre os reagentes de clique frescos, depois distribua 190 μL em cada poço, sele a placa e incube a 37°C por 1 h.
- Lavagem: Aspirar o líquido dos poços e lavar a placa 3x com PBST (volume sistólico de 180 μL, 15 tempos para cada lavagem).
- Ligação estreptavidina-peroxidase de rábano forte: Diluir estreptavidina-HRP (0,224 mg/mL) 1:10 em estreptavidina (0,224 mg/mL), diluir 1:1000 em PBST. Adicionar Steptavidin-HRP: mistura de estreptavidina (100 μL por poço) e incubar em RT por 1 h com agitação orbital suave.
- Lave 3x com PBST como nas etapas anteriores.
- Oxidação vermelha de Amplex
- Combinar os reagentes de detecção Amplex red da seguinte forma: 4,45 mL de tampão NaHPO4 (concentração final 1x = 50 mM), 50 μL de vermelho de amplex (20 mM diluído em DMSO), 500 μL de H2O2 diluído.
- Diluir H2O2 de 30% de estoque para 3% em 1x tampão NaHPO4 e, em seguida, adicionar 22,7 μL de 3% H2O2 em 977 μL de 1x tampão NaHPO4 (este é o H2O2 usado para a reação amplex). Adicionar 100 μL da mistura de reação vermelha de amplex por poço, incubar em RT por 30 min protegido da luz e, em seguida, detectar a excitação/emissão de fluorescência 571/585 nm usando um leitor de placa de fluorescência padrão.
- Cálculo da inibição enzimática: Calcular a porcentagem de inibição (Figura 3) de acordo com a seguinte fórmula:
, onde D é o valor de fluorescência das reações de controle tratadas apenas com DMSO, X é o valor das reações tratadas com compostos de teste e BG é o valor dos poços de fundo (controle do peptídeo H4, sem adição de enzima). - Curva de dose: Selecione os compostos de teste que inibem a atividade da enzima HAT1 para ensaios repetidos, com o composto diluído em série. Determinar empiricamente as diluições do composto. Por exemplo, comece com 2 mM de concentração de estoque e, em seguida, dilua em série 1:3 para oito diluições. Em seguida, diluir 1:20 em ensaios enzimáticos produzindo 100 μM de dose máxima.
- Plotagem da curva: Use a regressão de mínimos quadrados para ajustar as curvas de inibição dose-resposta (usando valores de inibição percentual do passo 3.10) no software de análise de dados (GraphPad Prism) e derive os valores de IC50 para cada composto (Figura 4).
- Reação de acetilação com acetil-CoA:
- Use isso para confirmar a atividade enzimática com o cofator nativo acetil-CoA em vez de 4-pentinoil-CoA. Realizar ensaios de acetilação HAT1 conforme descrito nas etapas 3.1-3.2 com acetil-CoA no lugar de 4-pentinoil-CoA.
- Identifique os produtos da reação em membranas de nitrocelulose (1-2 μL), deixe-os secar e, em seguida, dot-blot com anticorpos anti-H4-lisina-12-acetil ou anti-H4-lisina-5-acetil. Quantificar o sinal do immunoblot por densitometria.
, onde D é o valor de fluorescência das reações de controle tratadas apenas com DMSO, X é o valor das reações tratadas com compostos de teste e BG é o valor dos poços de fundo (controle do peptídeo H4, sem adição de enzima).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Curvas padrão em duplicata (16 poços) devem ser incluídas em cada placa para garantir o desempenho adequado do ensaio. Os dados da curva padrão devem ser estabelecidos em forma de tabela, com um intervalo de 100% a 0% de acordo com a proporção de peptídeo contendo Pra para peptídeo H4 nativo em solução (Tabela 1). O sinal vermelho de Amplex será o mais alto em poços de peptídeo H4 nativo de 100% pra/0% e o mais baixo em poços de peptídeo H4 nativo de 0% pra/100%. Após a fluorescência ter sido detectada e os poços serem medidos, o gráfico padrão resultante deve se ajustar a uma linha reta (Figura 2), embora a saturação do sinal em concentrações acima de 50% Pra possa ser observada. A mistura inadequada de peptídeos de controle Pra a H4 pode resultar em pouco ou nenhum sinal vermelho amplex ou alterações não lineares no sinal vermelho amplex entre 0-50% Pra. Os resultados adequados do sinal e da curva indicam que a reação química do clique ocorreu, e os dados podem ser analisados de acordo.
É importante sempre incluir reações de controle em triplicata: as reações tratadas com DMSO servem como controles negativos e as reações tratadas com H4K12CoA servem como controles positivos para inibição enzimática, respectivamente. Estes devem ser incluídos em cada placa para garantir um desempenho robusto do ensaio e permitir cálculos de Inibição de Porcentagem. Poços de controle positivo que contêm 1 μM de H4K12CoA devem ter um baixo sinal vermelho ampl, que é semelhante aos poços de peptídeo 0% Pra/100% H4. Poços de controle negativo contendo DMSO devem ter um sinal semelhante à saída fluorescente de poços com 50% de peptídeo Pra/50% H4. Os poços compostos de teste conterão sinais de amplex variados. Média duplicada, ou triplicata, de poços para obter um valor médio do sinal com erro padrão.
Calcule a inibição enzimática com a fórmula acima, onde D é a saída fluorescente DMSO, X é a saída experimental e BG é a saída do peptídeo H4 sem enzima ou o poço 0% na curva padrão. A saída de fluorescência das reacções do composto de ensaio será inferior à do DMSO se o composto de ensaio inibir a actividade enzimática e resultar em valores percentuais de inibição positivos. O efeito oposto será observado em reações onde não ocorreu inibição enzimática. Dados de exemplo de compostos de teste selecionados em duas concentrações (1 μM e 10 μM) são mostrados na Figura 3. Diluições seriadas dos compostos também podem ser testadas usando este ensaio, onde o CI50 do composto pode ser encontrado com ajuste de curva não linear dos dados (Figura 4).
Figura 1: HAT1 acetilação/acilação clique química esquemática. A reação de clique de acetilação HAT1 ocorre com as proteínas HAT1 e Rbap46 purificadas em uma solução com peptídeo H4 de histona biotinilado, 4-pentinoil-CoA e compostos teste. Depois que as reações são concluídas, a solução é ligada a uma placa revestida de neutravidina, e a química de clique com sulfato de cobre e biotina-azida é concluída. A adição final de estreptavidina-HRP e vermelho de amplex resulta em saída fluorescente vermelha. A comparação das intensidades de fluorescência do vermelho amplex determina a atividade de acetilação do HAT1. Esse valor foi modificado com permissão de Gaddameedi et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de curva padrão. Após a média dos valores da curva padrão para cada par, represente graficamente as médias ± EPM em relação às porcentagens de peptídeo Pra de controle positivo. A curva resultante deve ser semelhante à curva mostrada e ajustar uma linha linear. Esse ensaio tem um limite de detecção (LOD) de 1,8% ± 0,89% e um limite de quantificação (LOQ) de 5,4% ± 3,1%24. A curva padrão pode saturar para porcentagens de Pra >50%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ensaio de novos compostos em triplicata. O ensaio acetil-clique foi utilizado para avaliar a atividade inibitória de compostos recém-sintetizados. Os compostos foram diluídos a 10 μM e 1 μM para teste em triplicata, com mediana indicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diluição em série dos compostos de ensaio no ensaio HAT1 acetyl click. Os compostos foram diluídos de 100 μM a 0,01 μM e testados em duplicata. As curvas de dose resultantes mostram que os compostos A e C inibem a atividade do HAT1 em quase 100% para várias diluições. Os dados foram então utilizados para calcular o IC50 dos compostos a serem utilizados em experimentos posteriores. Os dados são médios ± MEV de experimentos duplicados. Os valores de R2 para ajustes não lineares são 0,84, 0,78 e 0,94 para os compostos A, B e C, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| % Controle Positivo | Peptídeo de Controle Positivo [2,5 rxns] "pra" diluído a 0,1 mg/mL em DMSO (contendo alquina) | Peptídeo H4 [2,5 rxns] diluído a 0,1 mg/mL em DMSO |
| 100 | 2,5 μL | - |
| 75 | 1,875 μL | 0,625 μL |
| 50 | 1,25 μL | 1,25 μL |
| 25 | 0,625 μL | 1,875 μL |
| 10 | 1 μL | 9 μL |
| 5 | 1,25 μL (de 1:10) | 1,25 μL |
| 1 | 1 μL (de 1:10) | 9 μL |
| 0 | - | 2,5 μL |
| Total | 8,5 μL | 25,5 μL |
Tabela 1: Diluição do peptídeo de controle Pra para peptídeo H4. Proporções de peptídeo "Pra" de controle positivo para peptídeo H4 que são usadas para criar uma curva padrão. Após a ressuspensão inicial do estoque de Pra a 4 mg/mL em DMSO, o mesmo deve ser diluído 1:40 em DMSO até a concentração final de 0,1 mg/mL. O peptídeo H4 biotinilado também deve ser diluído a 0,1 mg/mL (34,8 μM) em DMSO. Em seguida, cada peptídeo deve ser misturado nas proporções mostradas. Cada padrão será adicionado em duplicata à placa de 96 poços. Os valores de saída de fluorescência devem ser calculados em média para criar a curva padrão.
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Discussion
Na última década, a química de cliques tornou-se proeminente20, permitindo o projeto preciso de estruturas químicas interagentes. Dentro deste contexto, várias conexões covalentes bioortogonais21 têm emergido como opções promissoras para a formação de complexos em seu ambiente natural. A química de cliques emprega pares de grupos funcionais que exibem reações rápidas e seletivas, comumente conhecidas como "reações de clique". Estas reações ocorrem eficientemente em condições aquosas suaves e ecológicas. Apresentamos aqui o desenvolvimento de uma plataforma desenvolvida para identificar e caracterizar a atividade da acetiltransferaseHAT124. Esta plataforma utiliza um ensaio enzimático baseado em peptídeos de alto rendimento habilitado pela química de cliques.
Uma das principais vantagens deste ensaio é que ele se baseia no complexo enzimático HAT1/Rbap46 humano obtido da purificação de células humanas em vez de uma fonte bacteriana. Além disso, este método mede diretamente a atividade enzimática sobre o substrato peptídico, eliminando a necessidade de reações acopladas que possam ser suscetíveis à inibição inespecífica. Embora métodos baseados em anticorpos estejam disponíveis para avaliar a atividade enzimática21, o ensaio acetil-clique oferece vantagens distintas ao evitar variabilidade biológica e custos relacionados a anticorpos. Além disso, validamos com sucesso suas capacidades de alto rendimento em placas de 96 poços, tornando viável a realização de extensas telas químicas. A abordagem da química do clique pode provavelmente ser adaptada para uso com outras acetiltransferases também. Por exemplo, acetiltransferases recombinantes poderiam ser incubadas com outros peptídeos de histonas que mimetizam seus substratos naturais em combinação com 4-pentinoil-CoA para induzir a acilação peptídica. Em seguida, as etapas subsequentes do ensaio para ligação do peptídeo, funcionalização e oxidação do vermelho de amplex poderiam ser rapidamente adaptadas. Deve-se ter o cuidado de projetar controles positivos e negativos apropriados para curvas padrão, a fim de permitir a quantificação do ensaio.
Certas limitações do ensaio devem ser lembradas. Primeiro, embora esse protocolo tenha sido otimizado para HAT1, nem todas as acetiltransferases podem aceitar pentynoyl-CoA como um acetil-CoA mimético. Assim, o desenvolvimento de moléculas adicionais doadoras de acila poderia ser considerado26, ou mutagênese da bolsa catalítica pode ser necessária para permitir a aceitação de cofatores compatíveis comcliques 27,28. Em segundo lugar, como a afinidade por cofatores habilitados por clique pode diferir do cofator natural, recomenda-se o uso de ensaios de acompanhamento secundários para confirmar os resultados, por exemplo, detecção baseada em anticorpos (ver etapa 3.12). Finalmente, ensaios enzimáticos, biofísicos e celulares confirmatórios adicionais devem ser realizados para confirmar os resultados. A ligação de pequenas moléculas a complexos proteicos pode ser confirmada por instrumentos que medem a ressonância plasmônica de superfície, porexemplo29.
Há algumas etapas críticas a serem destacadas para garantir que o ensaio funcione sem problemas e que os resultados correspondentes sejam precisos. O crescimento exponencial de células 293f deve ser evidente antes e após a transfecção do DNA para alcançar uma boa expressão proteica. Plasmídeos que produzem alta expressão proteica em sistemas de transfecção transitória devem ser empregados, por exemplo, o plasmídeo pHEK-293 aqui utilizado. A enzima HAT1 é ativada pela forskolina neste protocolo, mas resultados semelhantes foram obtidos com o ortovanadato, sugerindo que modificações pós-traducionais são necessárias para a atividade do HAT1. Observamos que as preparações enzimáticas HAT1/Rbap46 purificadas são relativamente estáveis e podem sobreviver aos ciclos de congelamento/descongelamento sem perda da atividade enzimática. No entanto, recomendamos o congelamento de alíquotas enzimáticas em pequenas quantidades. Normalmente, não usamos enzimas após mais de um ciclo de congelamento/descongelamento.
Durante o ensaio de acetil-clique, é importante sempre incluir reações de controle em triplicata: as reações tratadas com DMSO servem como controles negativos e as reações tratadas com H4K12CoA servem como controles positivos para inibição enzimática, respectivamente. Os valores de fluorescência da reação enzimática tratada com DMSO devem cair na curva padrão linear entre 25 e 50 % de peptídeo Pra positivo para evitar a saturação do sinal. Isso pode exigir a titulação cuidadosa da quantidade da enzima HAT1/Rbap46 em reações de controle antes do teste de drogas. Por exemplo, a enzima HAT1/Rbap46 pode ser diluída 1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:75 e 1:100 em EB, então usada em reações acetil-clique para determinar a quantidade de enzima necessária para gerar sinal entre 25%-50% do peptídeo Pra. Descobrimos que a enzima 100 nM é tipicamente suficiente, mas deve ser determinada empiricamente para cada nova preparação de enzima. O objetivo da mistura de estreptavidina-HRP com estreptavidina é diminuir o sinal de oxidação da ampl. A diluição da estreptavidina pode ser ajustada ao sinal de saída conforme necessário. Se um sinal rápido for gerado, pode ser necessário ler a placa antes de 30 minutos para evitar a saturação do sinal. Durante a otimização inicial do ensaio, sugerimos a leitura em 5 min, 15 min e 30 min. As leituras seriais podem ser realizadas sem influenciar o sinal. Se o ensaio for bem calibrado, os sinais vermelhos gerados entre 5 min e 30 min devem ser dimensionados linearmente.
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Disclosures
Registramos patentes descrevendo o ensaio HAT1 acetil-clique (PCT/US20/29395). J.J.G. relata acordos de consultoria com Sharma Therapeutics, LLC e Guidepoint e apoio à pesquisa (para sua instituição) da Hummingbird Biosciences.
Acknowledgments
Agradecemos a George Zheng por fornecer H4K12CoA. Agradecemos aos membros do Gruber Lab pelas discussões e comentários úteis. Agradecemos o apoio do NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) e da V Foundation (V2022-022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
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