Summary
Snabba och noggranna kemiska analyser för att screena för specifika hämmare är ett viktigt verktyg i läkemedelsutvecklingsarsenalen. Här presenterar vi en skalbar acetylklickkemianalys för att mäta hämningen av HAT1-acetyleringsaktiviteten.
Abstract
HAT1, även känt som histonacetyltransferas 1, spelar en avgörande roll i kromatinsyntesen genom att stabilisera och acetylera begynnande H4 före nukleosommontering. Det krävs för tumörtillväxt i olika system, vilket gör det till ett potentiellt mål för cancerbehandling. För att underlätta identifieringen av substanser som kan hämma HAT1 enzymatisk aktivitet har vi tagit fram en acetylklickanalys för snabb screening. I denna enkla analys använder vi rekombinant HAT1/Rbap46, som renas från aktiverade mänskliga celler. Metoden använder acetyl-CoA-analogen 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klickkemisk metod. Detta involverar den enzymatiska överföringen av ett alkynhandtag genom en HAT1-beroende acyleringsreaktion till en biotinylerad H4 N-terminal peptid. Den infångade peptiden immobiliseras sedan på neutravidinplattor, följt av klickkemisk funktionalisering med biotinazid. Därefter används streptavidin-peroxidasrekrytering för att oxidera amplexrött, vilket resulterar i en kvantitativ fluorescerande produktion. Genom att introducera kemiska hämmare under acyleringsreaktionen kan vi kvantifiera enzymatisk hämning baserat på en reduktion av fluorescenssignalen. Det är viktigt att notera att denna reaktion är skalbar, vilket möjliggör screening av potentiella hämmare av HAT1-enzymatisk aktivitet med hög genomströmning.
Introduction
Bland de många eukaryota acetyltransferaserna var HAT1 det första histonacetyltransferaset som isolerades 1,2,3. Efterföljande undersökningar har fastställt dess centrala roll i kromatinreplikation, särskilt i syntesen av nya nukleosomer under S-fas4. Vår forskning ledde till erkännandet att HAT1 stimuleras starkt av behandling med epidermal tillväxtfaktor (EGF) ibröstceller5. Vidare har det framkommit att HAT1 krävs för snabb cellproliferation och tumörbildning in vivo 6,7,8,9. Data indikerar att HAT1 är avgörande för att koordinera anabola och epigenetiska processer för celldelning, vilket driver tumörtillväxt.
HAT1 di-acetylerar den aminoterminala svansen av histon H4 på lysinerna 5 och 12 i komplex med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen och presenterar aminoterminalen för HAT1. Histontetramerer eller disomer10, tillsammans med HAT1/Rbap46 och andra histonchaperoner11, importeras sedan till kärnan. Histoner frigörs sedan för att deponeras vid replikationsgaffeln eller andra platser för att stödja genaktivering eller repression. Funktionen av HAT1-di-acetyleringsmärket på histon H4 är inte helt klarlagd. Det avlägsnas sannolikt snabbt inom ett spann av 15-30 minuter genom verkan av histondeacetylaser 12,13,14,15 efter att H4 sätts in i kromatin. Således är HAT1-di-acetyleringsmärket inte förökat i kromatin och kan inte tjäna en verklig epigenetisk roll, även om en roll i rekryteringen av kromatinmodifierande enzymer till begynnande kromatin har postulerats12. HAT1 innehåller inte heller direkt acetylatkromatin; Dess aktivitet är begränsad till lösliga histoner.
Utvecklingen av småmolekylära histonacetyltransferashämmare har hämmats av ospecifika analyser med låg genomströmning, vilket ofta resulterat i generering av biologiskt reaktiva föreningar16,17. Guldstandardanalysen för att mäta acetyltransferasaktiviteter kräver användning av 3H-acetyl-coA, vilket begränsar genomströmningen och kräver strålning. Icke desto mindre har nyligen specifika och mycket potenta småmolekylära acetyltransferashämmare riktade mot CBP/p30018 och KAT6A/B19,20 beskrivits och bekräftats genom användning av 3H-acetyl-CoA. Framöver håller man på att ta fram förbättrade analyser för att uppnå bättre genomströmning och undvika laboratorierisker.
De senaste framstegen inom acetyleringsövervakning21 har använt klickkemi för att möjliggöra enzymatisk reaktionsövervakning. Det finns en mängd klickaktiverade prekursorer som är tillgängliga via enkla syntetiska vägar eller finns att köpa som kan införlivas i enzymreaktioner. Dessa reaktioner utförs vanligtvis i rekombinanta system, även om cellbaserade analyser också är möjliga22. Fördelen med klickaktiverade co-faktorer och substrat är att screening direkt kan mäta enzymaktivitet utan behov av kopplade avläsningssystem som ofta störs av screeningföreningar och kräver ytterligare hanteringssteg. Detta möjliggör inhibitorbehandlingar endast under det enzymatiska steget, medan alla nedströms funktionaliserings- och detektionssteg utförs efter omfattande tvättning för att avlägsna föreningar, vilket begränsar risken för att analysinterferens uppstår. Dessa fördelar gör att utformningen av klickaktiverade analyser är att föredra framför kopplade analyser som vanligtvis förlitar sig på detektion av fritt koenzym A.
En viktig faktor är acceptansen av klickaktiverade co-faktorer i enzymets aktiva säte. Befintliga klickaktiverade kofaktorer kanske inte är helt kompatibla med den aktiva webbplatsen som är optimerad för den inbyggda kofaktorn. Strukturell information och modellering kan användas för att designa aminosyrasubstitutioner för att förstora det aktiva stället för att införliva förändrade substrat23. Detta kan möjliggöra screening med förbättrad enzymkinetik och lägre substrat- och enzymnivåer. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att förändrade katalytiska fickor kanske inte identifierar hämmare som interagerar starkt med det ursprungliga enzymet. I slutändan krävs en kombination av tillvägagångssätt för att identifiera och validera potentiella enzymhämmare.
Här beskriver vi en metod som utvecklats för att rena och analysera HAT1-enzymaktivitet med hjälp av klickkofaktorn 4-pentynoyl-CoA24. Denna analys (figur 1) använder den nativa enzymsekvensen i komplex med dess nödvändiga partnerprotein Rbap46, vilket har visat sig öka enzymaktiviteten. Rening av enzymet från mänskliga celler möjliggör enzymaktivering i cellulo, vilket kan bevara stimulerande posttranslationella modifieringar som är viktiga för full enzymaktivitet. Design och optimering av rekombinanta enzymanalyser för kemiska screeningar med hög genomströmning har framgångsrikt använts för att identifiera och karakterisera HAT1 småmolekylära hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metod 1: Producera och rena rekombinant HAT1/Rbap46-komplex
- Upptining, återvinning och expansion av HEK293f-celler
- Tina 1-10 miljoner HEK293f däggdjursceller26 till 30 ml freestyle 293 expressionsmedia i en 100 mL kolv. Inkubera i 8 % CO2 vid 37 °C under rotation med 60 rpm.
- Nästa dag, räkna och kontrollera cellens viabilitet och justera sedan rotationshastigheten till 120 rpm. Expandera till 300 ml odling i en 1 L kolv, bibehåll sådddensiteten på 500 000 celler/ml och dela celler innan densiteten överstiger 3 x 106 celler/ml.
- HEK293f transfektion
- Frö 5 x 105 celler/ml i 300 ml kultur i en 1 L kolv och odla i 24 timmar. Nästa dag räknar du cellerna för att se till att de är mellan 7,5 x 105 och 1,2 x 106 celler/ml.
- Bered en blandning av 300 μg pHEK-FLAG-HAT1 och 300 μg pHEK-Rbap46 plasmid-DNA i 30 ml PBS. Tillsätt 1,2 ml polyetylenimin (PEI) till DNA/PBS och blanda. Inkubera i 20 minuter vid RT. Tillsätt DNA/PBS/PEI-blandningen till 300 ml grödan och inkubera vid 37 °C i 48 timmar vid 120 rpm.
- Skörda celler
- Räkna celler för att säkerställa att de faller mellan 1,7 x 106 till 2,5 x 106 celler/ml. Vid denna celltäthet, tillsätt forskolin till en slutlig koncentration av 12,5 μM för att aktivera HAT1 och inkubera celler i 30 min, 37 °C, 120 rpm.
- Pelletera cellerna med 300 x g i 5 minuter, tvätta en gång med 30 ml PBS och snap-frys i vätska N2. Förvaras vid -80 °C tills proteinet renings eller går direkt till rening.
- HAT1/Rbap46 komplex FLAG-pärlrening
- Lyse-celler och förbered proteinextrakt.
- Bered lyseringsbuffert genom att tillsätta en tablett proteashämmarcocktail (PIC) till 50 ml RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2).
- Tina cellpelleten från 300 ml kultur på is och lyse med 40 ml iskall lyseringsbuffert med 0,1 % Triton X-100. Ultraljudsbehandling på is och centrifugera sedan vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Samla all supernatant i ett 50 ml rör på is, som nu är proteinextraktet.
- Förbered FLAG-pärlor.
- Dela FLAG-pärlorna i fyra 15 ml koniska rör genom att tillsätta 400 μL M2-FLAG agarospärlslam i varje rör som innehåller 5 ml 0,1 M glycin pH 3,5, 0,01 % Triton X-100. Skaka varje rör kraftigt i 5 s för hand.
- Pulscentrifugera i 30 s vid 1000 x g vid 4 °C, aspirera supernatant, tvätta två gånger med 5 ml RSB-500 + 0,1 % Triton X-100 (Tx-100; ingen proteashämmare) och inkubera på is.
- Utför FLAG-immunprecipitering.
- Tillsätt 10 ml proteinextrakt till varje 15 ml koniskt rör som innehåller tvättade pärlor. Inkubera rören vid 4 °C med inverterad rotation i minst 90 minuter eller över natten.
- Tvätta de bundna pärlorna 5x i 10 ml RSB-500 + 0,1 % Tx-100. För varje tvätt, vänd röret 2x-5x för att återsuspendera pärlorna, sedan pellets vid 1000 x g i 1 min vid 4 °C. Tvätta slutligen 1x i RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2) + 0,1% Tx-100.
- FLAG-peptideluering: Eluera HAT1-komplexet i 1,5 ml elueringsbuffert (EB) innehållande 0,5 mg/ml FLAG-peptid. Inkubera vid 4 °C i minst 1 timme eller över natten. Pulscentrifugera de eluerade kulorna vid 1000 x g i 30 s vid 4 °C och samla upp supernatanten, som innehåller det renade HAT1/Rbap46-komplexet.
- Koncentra protein och ta bort FLAG-peptiden.
- Tillsätt eluate till ett 20 ml, 10 000 Dalton cutoff filterrör. Höj volymen till 15 ml med EB. Centrifugera i 2500 x g i 15 minuter vid 4 °C, upprepa två gånger med ytterligare 15 ml EB varje gång.
- Återvinn det slutliga eluatet från filterröret och kontrollera proteinkoncentrationen med A260. Förvänta dig en koncentration på 1 mg totalt protein i 6 ml EB (per 300 ml startkultur). Kontrollera proteinets renhet med SDS-PAGE, Coomassie och immunoblot och förvara alikvoter vid -80 °C.
- Lyse-celler och förbered proteinextrakt.
2. Metod 2: HAT1 acetyl-klick standardkurva
- Förbereda standardkurva
- Syntetisera en positiv kontroll H4 N-terminal peptid med sekvensen: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotin)], där [Pra] betecknar propargylglycin.
- Återsuspendera Pra-peptiden till 0,1 mg/ml i DMSO. Blanda Pra-peptiden med biotinylerad histon H4-peptid (1-23-GGK-biotin) för att skapa en standardkurva (figur 2; volymer finns i tabell 1). Standardkurvor kan göras på nytt före plåtbindningen eller, om de gjorts i förväg, blandas med 20 μl 8 M urea och lagras vid -20 °C fram till steg 3.3.
3. Metod 3: HAT1 acetylklickanalys
- Montering av acetyleringsreaktioner med testhämmare
- Sätt ihop acetyleringsreaktioner i duplikat i 0,2 ml PCR-rör eller 96-håls PCR-plattor från följande komponenter: biotinylerad histon H4-peptid (1-23-GGK-biotin) resuspenderad i DMSO till 0,1 mg/ml (34,8 μM), HAT1-enzym förutspätt i EB, 20x buffert (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), 2 mM DTT, 4-pentynoyl-CoA upplöst i vatten till 1 mg/ml (1 mM). En 20 μL-reaktion består av 10 μL enzym, 1 μL H4-peptid, 1 μL 20x buffert, 1 μL DTT förblandad och alikvoterad till brunnar på en 96-håls PCR-platta på is.
- Tillsätt 1 μl DMSO (negativ kontroll) eller testförening löst vid 1–10 μM, eller H4K12CoA25 (eller lämplig positiv kontrollhämmare) per brunn. Blanda försiktigt med pipettering och inkubera i 10 minuter på is så att enzym-/hämmarkomplex bildas.
- Fortsättning av acetyleringsreaktionen
- Blanda 2 μL 4-pentynoyl-CoA med 4 μL vatten och tillsätt sedan i brunnarna. Blanda försiktigt med pipettering, centrifugera vid 300 x g i 30 s vid RT för att samla upp innehållet och inkubera vid 37 °C i 1 timme i förslutna rör eller plattor med återförslutningsbar folie.
- Bearbeta innehållet direkt för reaktionsprodukter eller kyl med 20 μl 8 M urea och förvara vid -20 °C fram till bearbetningen.
- Peptidbindning till neutravidinplatta
- Tillsätt reaktionsinnehåll med eller utan urea till bovint serumalbumin (BSA) förblockerat svart neutravidinbelagda 96-brunnars plattor innehållande 80 μL PBST (PBS + 0,1 % Tween-20) per brunn.
- Tillsätt standardkurvpeptider i två exemplar till sina egna brunnar som innehåller 80 μL PBST. Bind peptider med försiktig orbital skakning i 1 timme vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta: När bindningen är klar, aspirera vätskan från brunnarna och tvätta brunnarna med 200 μL PBST 3x 15 slag (180 μL slagvolym) med en plattbricka.
- Klicka på kemi reaktion
- Bered reagenserna för klickreaktionen enligt följande: 100 mM Tris(3-hydroxipropyltriazolymetyl)amin (THPTA) ligand i vatten och 20 mM CuSO4 i vatten. THPTA förhindrar Cu(II)-katalyserad hydrolys och släcker radikaler och peroxider som genereras från O2/Cu/askorbat.
- Tillsätt THPTA/Cu-blandningen till 300 mM natriumaskorbat i vatten och 2,5 mM biotinazid i DMSO. Reaktion med ett klick innehåller 140 μL PBS, 10 μL THPTA, 10 μL CuSO4, 10 μL natriumaskorbat, 20 μL biotinazid. Blanda alltid klickreagenserna färska, fördela sedan 190 μL till varje brunn, förslut plattan och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Tvätta: Sug upp vätskan från brunnarna och tvätta plattan 3 gånger med PBST (180 μL slagvolym, 15 slag för varje tvätt).
- Streptavidin-pepparrotsperoxidasbindning: Späd streptavidin-HRP (0,224 mg/ml) 1:10 i streptavidin (0,224 mg/ml), späd sedan ytterligare 1:1000 i PBST. Tillsätt Steptavidin-HRP: streptavidinblandning (100 μl per brunn) och inkubera vid RT i 1 timme med försiktig orbitalskakning.
- Tvätta 3 gånger med PBST som i föregående steg.
- Amplex röd oxidation
- Kombinera Amplex röda detektionsreagenser enligt följande: 4,45 ml NaHPO4-buffert (1x = 50 mM slutlig koncentration), 50 μL amplexröd (20 mM utspädd i DMSO), 500 μL utspädd H2O2.
- Späd H2O2 från 30 % stam till 3 % i 1x NaHPO4-buffert och tillsätt sedan 22,7 μl 3 % H2O2 till 977 μl 1x NaHPO4 buffert (detta är H2O2 som används för amplexreaktionen). Tillsätt 100 μl av den röda amplexreaktionsblandningen per brunn, inkubera vid RT i 30 minuter skyddad från ljus och detektera sedan fluorescensexcitationen/-emissionen 571/585 nm med hjälp av en vanlig fluorescensplattläsare.
- Beräkning av enzymhämning: Beräkna den procentuella hämningen (figur 3) enligt följande formel:
, där D är fluorescensvärdet för kontrollreaktioner som endast behandlats med DMSO, X är värdet för reaktioner som behandlats med testföreningar och BG är värdet för bakgrundsbrunnar (H4-peptidkontroll, inget enzym tillsatt). - Doskurva: Välj testföreningar som har visat sig hämma HAT1-enzymaktiviteten för upprepade analyser, med föreningen serieutspädd. Bestäm de sammansatta utspädningarna empiriskt. Börja till exempel med en lagerkoncentration på 2 mM och späd sedan serievis 1:3 i åtta spädningar. Späd sedan 1:20 i enzymanalyser som ger 100 μM toppdos.
- Plotta kurvan: Använd minstakvadratregression för att passa dos-responshämningskurvor (med hjälp av procentuella hämningsvärden från steg 3.10) i dataanalysprogram (GraphPad Prism) och härled IC50-värden för varje förening (figur 4).
- Acetyleringsreaktion med acetyl-CoA:
- Använd detta för att bekräfta enzymaktiviteten med den naturliga co-faktorn acetyl-CoA istället för 4-pentynoyl-CoA. Utför HAT1-acetyleringsanalyser enligt beskrivningen i steg 3.1-3.2 med acetyl-CoA i stället för 4-pentynoyl-CoA.
- Spot reaktionsprodukterna på nitrocellulosamembran (1-2 μL), låt dem torka och dot-blot sedan med anti-H4-lysin-12-acetyl- eller anti-H4-lysin-5-acetyl-antikroppar. Kvantifiera immunoblot-signalen med hjälp av densitometri.
, där D är fluorescensvärdet för kontrollreaktioner som endast behandlats med DMSO, X är värdet för reaktioner som behandlats med testföreningar och BG är värdet för bakgrundsbrunnar (H4-peptidkontroll, inget enzym tillsatt).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standardkurvor i duplikat (16 brunnar) bör inkluderas på varje platta för att säkerställa korrekt analysprestanda. Standardkurvdata bör ställas in i tabellform, med ett intervall på 100 % till 0 % beroende på förhållandet mellan Pra-innehållande peptid och naturlig H4-peptid i lösning (tabell 1). Amplex röda signal kommer att vara högst i 100 % pra/0 % nativt H4-peptidbrunnar och lägst i 0 % pra/100 % nativt H4-peptidbrunnar. Efter att fluorescens har detekterats och brunnarna har beräknats i medelvärde, bör den resulterande standardgrafen passa en rät linje (figur 2), även om signalmättnad vid koncentrationer över 50 % Pra kan observeras. Felaktig blandning av Pra till H4-kontrollpeptider kan resultera i liten eller ingen amplex röd signal eller icke-linjära förändringar i amplex röd signal mellan 0-50 % Pra. Korrekta signal- och kurvresultat indikerar att klickkemireaktionen har inträffat, och data kan analyseras därefter.
Det är viktigt att alltid inkludera tre kontrollreaktioner: DMSO-behandlade reaktioner fungerar som negativa kontroller respektive H4K12CoA-behandlade reaktioner fungerar som positiva kontroller för enzymhämning. Dessa bör inkluderas på varje platta för att säkerställa robust analysprestanda och möjliggöra beräkningar av procentuell hämning. Positiva kontrollbrunnar som innehåller 1 μM H4K12CoA bör ha en röd signal med låg amplex, vilket liknar 0 % Pra/100 % H4-peptidbrunnar. Negativa kontrollbrunnar som innehåller DMSO bör ha en signal som liknar den fluorescerande produktionen från brunnar med 50 % Pra/50 % H4-peptid. Provbrunnar kommer att innehålla varierande amplexsignaler. Medelvärde av duplicerade, eller tredubbla, brunnar för att få ett medelvärde av signalen med standardfel.
Beräkna enzymhämning med formeln ovan där D är DMSO-fluorescerande utgång, X är experimentell utgång och BG är utmatning från H4-peptiden utan enzym eller 0%-brunnen på standardkurvan. Fluorescenseffekten från testföreningsreaktionerna är mindre än DMSO om testsubstansen hämmar enzymaktiviteten och ger positiva procentvärden för hämning. Den motsatta effekten kommer att ses i reaktioner där ingen enzymhämning har skett. Exempeldata för testföreningar som screenats i två koncentrationer (1 μM och 10 μM) visas i figur 3. Serieutspädningar av föreningarna kan också testas med hjälp av denna analys, där IC50 för föreningen kan hittas med icke-linjär kurvanpassning av data (figur 4).
Figur 1: HAT1-acetylering/acylering klickkemischematisk. HAT1-acetyleringsklickreaktionen sker med renat HAT1- och Rbap46-protein i en lösning med biotinylerad histon H4-peptid, 4-pentynoyl-CoA och testföreningar. Efter att reaktionerna är slutförda binds lösningen till en neutravidinbelagd platta, och klickkemi med kopparsulfat och biotinazid är avslutad. Den slutliga tillsatsen av streptavidin-HRP och amplexrött resulterar i röd fluorescerande effekt. Jämförelse av amplexröda fluorescensintensiteter bestämmer HAT1-acetyleringsaktiviteten. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Gaddameedi et al.24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på standardkurva. Efter att ha beräknat medelvärdet av standardkurvvärdena för varje par, rita upp medelvärdena ± SEM mot de positiva kontrollprocentsatserna för Pra-peptider. Den resulterande kurvan ska likna den visade kurvan och passa en linjär linje. Denna analys har en detektionsgräns (LOD) på 1,8 % ± 0,89 % och en kvantifieringsgräns (LOQ) på 5,4 % ± 3,1 %24. Standardkurvan kan mättas för Pra-procentsatser >50 %. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Testning av nya föreningar i tre exemplar. Acetylklickanalys användes för att bedöma den hämmande aktiviteten hos nysyntetiserade föreningar. Föreningarna späddes till 10 μM och 1 μM för testning i tre exemplar, med median angiven. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Seriell utspädning av testsubstanser i HAT1-acetylklickanalys. Föreningarna späddes från 100 μM till 0,01 μM och testades i två exemplar. De resulterande doskurvorna visar att föreningarna A och C hämmar HAT1-aktiviteten med nästan 100 % under flera spädningar. Data användes sedan för att beräkna IC50 för föreningar som skulle användas i ytterligare experiment. Data är medelvärdet ± SEM för dubbla experiment. R2-värden för olinjära passningar är 0,84, 0,78 och 0,94 för föreningarna A, B respektive C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| % positiv kontroll | Positiv kontrollpeptid [2,5 rxns] "pra" utspädd till 0,1 mg/ml i DMSO (alkyninnehållande) | H4-peptid [2,5 rxns] utspädd till 0,1 mg/ml i DMSO |
| 100 | 2,5 μL | - |
| 75 | 1,875 μL | 0,625 μL |
| 50 | 1,25 μL | 1,25 μL |
| 25 | 0,625 μL | 1,875 μL |
| 10 | 1 μL | 9 μL |
| 5 | 1,25 μL (av 1:10) | 1,25 μL |
| 1 | 1 μL (av 1:10) | 9 μL |
| 0 | - | 2,5 μL |
| Total | 8,5 μL | 25,5 μL |
Tabell 1: Spädning av Pra-kontrollpeptid till H4-peptid. Förhållandet mellan positiv kontrollpeptid "Pra" och H4-peptid som används för att skapa en standardkurva. Efter att Pra-stammen initialt återsuspenderats vid 4 mg/ml i DMSO, måste den spädas 1:40 i DMSO till en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml. Biotinylerad H4-peptid måste också spädas till 0,1 mg/ml (34,8 μM) i DMSO. Därefter ska varje peptid blandas ihop i de visade proportionerna. Varje standard kommer att läggas till i två exemplar till 96-hålsplattan. Fluorescensutgångsvärdena bör beräknas tillsammans för att skapa standardkurvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det senaste decenniet har klickkemi blivit framträdande20, vilket möjliggör exakt design av interagerande kemiska strukturer. I detta sammanhang har olika bioortogonala kovalenta förbindelser21 dykt upp som lovande alternativ för att bilda komplex i deras naturliga miljö. Klickkemi använder par av funktionella grupper som uppvisar snabba och selektiva reaktioner, allmänt kända som "klickreaktioner". Dessa reaktioner sker effektivt under miljövänliga, skonsamma vattenhaltiga förhållanden. Här presenterar vi utvecklingen av en plattform utformad för att identifiera och karakterisera HAT1-acetyltransferasaktivitet24. Denna plattform använder en peptidbaserad enzymatisk analys med hög genomströmning som möjliggörs av klickkemi.
En av de viktigaste fördelarna med denna analys är att den förlitar sig på det humana enzymkomplexet HAT1/Rbap46 som erhålls från mänsklig cellrening snarare än en bakteriell källa. Dessutom mäter denna metod direkt enzymatisk aktivitet på peptidsubstratet, vilket eliminerar behovet av kopplade reaktioner som kan vara mottagliga för ospecifik hämning. Även om det finns antikroppsbaserade metoder för att bedöma enzymaktivitet21, erbjuder acetylklickanalysen tydliga fördelar genom att undvika biologisk variabilitet och antikroppsrelaterade kostnader. Dessutom har vi framgångsrikt validerat dess kapacitet med hög genomströmning i 96-brunnars plattor, vilket gör det möjligt att genomföra omfattande kemiska screeningar. Klickkemimetoden kan sannolikt anpassas för användning med andra acetyltransferaser också. Till exempel kan rekombinanta acetyltransferaser inkuberas med andra histonpeptider som efterliknar deras naturliga substrat i kombination med 4-pentynoyl-CoA för att inducera peptidacylering. Då kan de efterföljande analysstegen för peptidbindning, funktionalisering och amplex röd oxidation snabbt anpassas. Försiktighet bör iakttas för att utforma lämpliga positiva och negativa kontroller för standardkurvor för att möjliggöra analyskvantifiering.
Vissa begränsningar i analysen bör hållas i åtanke. För det första, även om detta protokoll har optimerats för HAT1, kan inte alla acetyltransferaser acceptera pentynoyl-CoA som en acetyl-CoA-mimetika. Således kan utvecklingen av ytterligare acyldonatormolekyler övervägas26, eller så kan mutagenes i den katalytiska fickan krävas för att tillåta acceptans av klickkompatibla kofaktorer 27,28. För det andra, eftersom affiniteten för klickaktiverade kofaktorer kan skilja sig från den naturliga kofaktorn, rekommenderas det att använda sekundära uppföljningsanalyser för att bekräfta resultat, till exempel antikroppsbaserad detektion (se steg 3.12). Slutligen bör ytterligare bekräftande enzymatiska, biofysiska och cellulära analyser utföras för att bekräfta resultaten. Bindning av små molekyler till proteinkomplex kan bekräftas med instrument som mäter ytplasmonresonans, till exempel29.
Det finns några kritiska steg att lyfta fram för att säkerställa att analysen går smidigt och att motsvarande resultat är korrekta. Den exponentiella tillväxten av 293f-celler bör vara tydlig före och efter DNA-transfektion för att uppnå ett bra proteinuttryck. Plasmider som ger högt proteinuttryck i transienta transfektionssystem bör användas, till exempel plasmiden pHEK-293 som används här. HAT1-enzymet aktiveras av forskolin i detta protokoll, men liknande resultat har uppnåtts med ortovanadat, vilket tyder på att posttranslationella modifieringar är nödvändiga för HAT1-aktivitet. Vi har observerat att renade HAT1/Rbap46-enzympreparat är relativt stabila och kan överleva frys-/upptiningscykler utan förlust av enzymaktivitet. Vi rekommenderar dock att du fryser in enzymalikvoter i små mängder. Vi använder vanligtvis inte enzymer efter mer än en frys-/upptiningscykel.
Under acetylklickanalysen är det viktigt att alltid inkludera tre kontrollreaktioner: DMSO-behandlade reaktioner fungerar som negativa kontroller respektive H4K12CoA-behandlade reaktioner fungerar som positiva kontroller för enzymhämning. DMSO-behandlade enzymreaktionsfluorescensvärden bör ligga på den linjära standardkurvan mellan 25 och 50 % positiv Pra-peptid för att undvika signalmättnad. Detta kan kräva noggrann titrering av mängden HAT1/Rbap46-enzym i kontrollreaktioner före läkemedelstestning. Till exempel kan enzymet HAT1/Rbap46 spädas 1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:75 och 1:100 i EB och sedan användas i acetylklickreaktioner för att bestämma mängden enzym som krävs för att generera signal mellan 25%-50% av Pra-peptiden. Vi har funnit att 100 nM enzym vanligtvis är tillräckligt men bör bestämmas empiriskt för varje ny beredning av enzym. Syftet med att blanda streptavidin-HRP med streptavidin är att minska amplexoxidationssignalen. Spädningen av streptavidin kan justeras till utsignalen efter behov. Om en snabb signal genereras kan det vara nödvändigt att läsa av plattan före 30 minuter för att undvika signalmättnad. Under den första analysoptimeringen föreslår vi avläsning vid 5 min, 15 min och 30 min. Seriella avläsningar kan utföras utan att påverka signalen. Om analysen är väl kalibrerad bör de röda amplexsignalerna som genereras mellan 5 min och 30 min skalas linjärt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har lämnat in patent som beskriver HAT1-acetylklicksanalysen (PCT/US20/29395). J.J.G. rapporterar konsultavtal med Sharma Therapeutics, LLC och Guidepoint och forskningsstöd (till sin institution) från Hummingbird Biosciences.
Acknowledgments
Vi tackar George Zheng för att han tillhandahöll H4K12CoA. Vi tackar medlemmarna i Gruber-labbet för hjälpsamma diskussioner och feedback. Vi tackar för stöd från NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) och V Foundation (V2022-022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
- Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
- Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
- Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
- Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
- Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
- Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
- Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
- Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
- Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
- Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
- Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
- Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
- Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
- Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
- Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
- Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
- He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
- Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).
- Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
- Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
- Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
- Parker, C. G., Pratt, M. R.
- Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
- Radziwon, K., Weeks, A. M.
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
