Zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie
Summary
Die zyklische Multiplex-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen In-situ-Nachweis mehrerer Marker durch wiederholte Antigen-Antikörper-Inkubation, Bildscannen sowie Bildausrichtung und -integration. Hier stellen wir das Operationsprotokoll zur Identifizierung von Immunzellsubstraten mit dieser Technologie in Lungenkrebs- und gepaarten Hirnmetastasenproben vor.
Abstract
Die Tumormikroumgebung beinhaltet Wechselwirkungen zwischen Wirtszellen, Tumorzellen, Immunzellen, Stromazellen und Gefäßen. Die Charakterisierung und räumliche Organisation von Immunzelluntergruppen und Zielproteinen ist für prognostische und therapeutische Zwecke von entscheidender Bedeutung. Dies hat zur Entwicklung von Multiplex-Immunhistochemie-Färbemethoden geführt. Die Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis der Zellfunktion und der interzellulären Interaktionen. In diesem Artikel beschreiben wir einen Arbeitsablauf für den zyklischen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Assay und seine Anwendung in der Quantifizierungsanalyse von Lymphozyten-Untergruppen. Die zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung folgt ähnlichen Schritten und Reagenzien wie die Standard-Immunhistochemie, einschließlich Antigengewinnung, zyklischer Antikörperinkubation und Färbung auf einem formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeobjektträger. Während der Antigen-Antikörper-Reaktion wird eine Mischung aus Antikörpern verschiedener Spezies hergestellt. Bedingungen, wie z. B. die Antigen-Retrieval-Zeit und die Antikörperkonzentration, werden optimiert und validiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Diese Technik ist reproduzierbar und dient als wertvolles Werkzeug für die Immuntherapieforschung und klinische Anwendungen.
Introduction
Hirnmetastasen (BM) stellen die häufigsten Tumoren des zentralen Nervensystems (ZNS) dar, die bei fast der Hälfte der Fälle von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) auftreten und eine schlechte Prognosehaben 1. Schätzungsweise 10 % bis 20 % der NSCLC-Patienten haben zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bereits eine BM, und etwa 40 % der NSCLC-Fälle entwickeln im Verlauf der Behandlung eine BM2. Die Tumormikroumgebung (TME) ist eng mit dem Auftreten und der BM von NSCLC verbunden, einschließlich verschiedener Komponenten wie Blutgefäße, Fibroblasten, Makrophagen, extrazelluläre Matrix (EZM), lymphoide, aus dem Knochenmark stammende Immunzellen und Signalmoleküle 3,4. Mikroumgebungs-Immunzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Beeinflussung des Wachstums und der Entwicklung von Krebszellen. Hirnmetastasen stellen zahlreiche potenzielle Behandlungsziele dar, die durch komplexe immunologische Mikroumgebungen und Signalprozesse gekennzeichnet sind. Beispielsweise haben PD-1-Inhibitoren klinische Wirksamkeit bei Patienten mit Lungenkrebs-Hirnmetastasen (LCBM) als Immun-Checkpoint-Inhibitor (ICI) gezeigt. Die Häufigkeit des Ansprechens auf die PD-1-Therapie variiert jedoch zwischen primärem NSCLC und LCBM5, was darauf hindeutet, dass die Tumorimmunmikroumgebung als kritischer ICI-Regulator fungiert.
Die Immunhistochemie (IHC) ist ein unschätzbares Werkzeug in den Bereichen Biologie, Grundlagenmedizin und Pathologie6. Diese Nachweismethode visualisiert die Antigenexpression durch die Interaktion von Antigen-Antikörper auf einem Gewebeobjektträger7. IHC wird zur Diagnose prädiktiver Marker, zur Bewertung prognostischer Marker, zur Steuerung gezielter Therapien und zur Erforschung der biologischen Funktionen von Tumorzellen verwendet8. Die traditionelle IHC-Methode kann jedoch jeweils nur einen Biomarker nachweisen. Um diese Einschränkung zu beheben, hat die Innovation der immunhistochemischen Technologie zur Entwicklung der Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC) geführt, die die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Proteinmarker auf demselben Gewebeobjektträger ermöglicht, sowohl im Hellfeld als auch im Fluoreszenzfeld9. Dieser Fortschritt ermöglicht eine genaue Analyse der Zellzusammensetzung und der molekularen Wechselwirkungen zwischen Stromazellen, Immunzellen und Krebszellen innerhalb der TME.
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für zyklische Multiplex-Immunhistochemie vor, um die räumliche Verteilung von Immunzellen zu analysieren. Zwei Primärantikörper verschiedener Spezies, wie Kaninchen und Ratte, werden gleichzeitig für die Inkubation ausgewählt, gefolgt von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Die Antigen-Retrieval wird nach jeder Runde der Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt. Die Autofluoreszenz wird blockiert und 4′, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wird zur Färbung der Zellkerne verwendet. Das Panel umfasst den sequentiellen Nachweis von CD3, CD8, CD20 und CK, die Zellen werden nach den Markern kategorisiert: Tumorzellen (CK+), reife T-Zellen (CD3+), zytotoxische T-Zellen (CD3+CD8+), B-Zellen (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben den Prozess für die zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung beschrieben. Die Auswahl der primären Antikörper ist ein entscheidender Aspekt des Fluoreszenz-Immunhistochemie-Assays, und monoklonale Antikörper werden für eine bessere Spezifität und Wiederholbarkeit empfohlen. Um die Arbeitskonzentration des primären Antikörpers zu optimieren, wurde eine Reihe von Verdünnungen durch immunhistochemische Experimente getestet. Sowohl Positivkontrollen (zur Beurteilung der Zielantigenexpressi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), dem Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), der Scientific Research Foundation of Education Department der Provinz Yunnan (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
