Summary
Описаны новые, простые методики синтеза и характеристики биосовместимых микро- и субмикронных частиц лигнина. Эти составы обеспечивают простой подход к использованию гетерополимера, а также альтернативу для рационального проектирования многофункциональных матриц носителей с потенциальной применимостью в биомедицине, фармацевтической технологии и пищевой промышленности.
Abstract
Применение биополимерных микро-/нанотехнологий в человеческой, ветеринарной, фармацевтической и пищевой технике быстро растет в связи с большим потенциалом частиц на основе биополимеров в качестве эффективных систем-носителей. Использование лигнина в качестве основной гетерополимерной биоматрицы для разработки инновационных микро-/субмикронных составов позволяет достичь повышенной биосовместимости и предлагает различные активные функциональные группы, представляющие возможности для индивидуализации физико-химических свойств и биологической активности составов для различных применений. Целью настоящего исследования явилась разработка простой и экологичной методики синтеза частиц лигнина микро- и субмикронного размера; оценить их физико-химические, спектральные и структурные характеристики; и изучить их способность к инкапсуляции биологически активных молекул и потенциал высвобождения биофлавоноидов in vitro в смоделированных желудочно-кишечных средах. В представленных методиках применяются дешевые и экологически чистые растворители; Простые, простые, быстрые и чувствительные процессы, требующие небольшого количества оборудования, нетоксичных веществ и простых методов для их характеристики, определения инкапсуляционной способности к плохо растворимым в воде биологически активных соединений морина и кверцетина, а также потенциала высвобождения лигниновых матриц in vitro .
Introduction
В настоящее время склонность к биополимерам, таким как целлюлоза, хитозан, коллаген, декстран, желатин и лигнин, в качестве прекурсоров для разработки микро- и субмикронных носителей с настраиваемым размером, физико-химическими свойствами и биофункциональностью, возросла в биомедицинской, фармацевтической и пищевой промышленности из-за их применимости в тканевой инженерии, 3D-биопечати, in vitro платформы моделирования заболеваний, упаковочная промышленность, приготовление эмульсий и доставка питательных веществ, среди прочего 1,2,3.
Новые исследования подчеркивают аспекты гидрогелей на основе лигнина, а также микро- и наносоставов4 как предпочтительных носителей, используемых для упаковочных материалов для пищевых продуктов5, накопителей энергии6, косметики7, термостабилизаторов/светостабилизаторов, армированных материалов и матриц носителей лекарств8 для доставки гидрофобных молекул, улучшения УФ-барьеров9, в качестве армирующих агентов в нанокомпозитах, а также в качестве альтернативы неорганическим наночастицам в связи с некоторыми недавними проблемами безопасности 10,11,12. Причиной этой тенденции является биосовместимость, биоразлагаемость и нетоксичность природного гетеробиополимера, а также его доказанная биологическая активность лигнин-антиоксидантного потенциала и поглощения радикалов, антипролиферативная и антимикробная активность 13,14,15,16,17.
В научной литературе описываются различные методы синтеза (самосборка, осаждение против растворителей, кислотное осаждение и сдвиг растворителя)18 и характеристика микро-/наноразмерных составов на основе лигнина, включая применение дорогостоящих или вредных растворителей, таких как тетрагидрофуран (ТГФ), диметилсульфоксид (ДМСО), N,N-диметилформамид (ДМФА) и ацетон, а также сложные, непрямые и утомительные процессы, в которых используется много оборудования и токсичных веществ.,19,20.
Для преодоления последних недостатков в следующих протоколах представлены новые методики синтеза микро- и субмикронных частиц на основе лигнина с использованием дешевых и экологически чистых растворителей; простые, простые, быстрые и чувствительные процессы, требующие небольшого количества оборудования, нетоксичных веществ и простых методов для их характеризации и определения инкапсуляционной способности к плохо растворимым в воде биологически активным соединениям и потенциала высвобождения лигниновых матриц in vitro . Представленные лабораторные методы производства выгодны для производства функциональных носителей лигнина с перестраиваемыми размерами, высокой инкапсулирующей способностью и устойчивым поведением высвобождения in vitro с использованием простых процедур определения характеристик и экологически чистых химических веществ, которые могут найти применение в различных областях биомедицинских наук и пищевых технологий. Два флавоноида применялись в качестве молекул-мишеней, инкапсулированных в частицы лигнина: морин — в микрочастицы, а кверцетин — в субмикронные частицы. Различие в структурах обоих флавоноидов заключается только в положении второй -OH-группы в В-ароматическом кольце: -ОН-группа находится в 2'-положении в морине и в 3'-положении в кверцетине, таким образом, оба органических соединения являются позиционными изомерами. Последний факт предполагает сходное поведение обоих биологически активных природных соединений в процессах инкапсуляции и/или высвобождения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез микрочастиц лигнина
- Приготовьте водный раствор щелочного лигнина 50 мг/мл, растворив 2,5 г щелочного лигнина в 50 мл сверхчистой воды на магнитной мешалке.
- Приготовьте 1% раствор Tween 80, растворив 1 мл Tween 80 в 100 мл сверхчистой воды.
- Приготовьте 2 М раствор HNO3 путем разбавления 6,65 мл 67% HNO3 (плотность = 1,413 г/мл) со сверхчистой водой до конечного объема 50 мл.
- Медленно добавьте 15 мл 1% раствора Tween 80 к 50 мл раствора щелочного лигнина 50 мг/мл.
- Перемешивайте смесь на магнитной мешалке при 500 об/мин в течение 10 мин, чтобы поверхностно-активное вещество хорошо диспергировалось.
- Добавьте в смесь 20 мл 2 М HNO3 по каплям с помощью шприца со скоростью потока примерно 150 мкл/с.
- Продолжайте помешивать смесь в течение 30 минут, пока темно-коричневый раствор не превратится в светло-коричневую суспензию микрочастиц.
- Перенесите суспензию в пробирки объемом 1,5-2 мл и центрифугируйте в течение 30 мин при 15 000 × г в ультрацентрифуге при 10 °C.
- Соберите надосадочную жидкость для дальнейших анализов и промойте микрочастицы сверхчистой водой.
- Повторите процедуры ополаскивания/ультрацентрифугирования 3 раза.
- Перед ультразвуковой гомогенизацией емкость с микрочастицами опустить на ледяную баню.
- Гомогенизировать микрочастицы в течение 4 мин с интенсивностью 93% на ультразвуковом гомогенизаторе.
- Лиофилизируйте микрочастицы при температуре -64 °C в сублимационной сушилке и храните их в эксикаторе для дальнейшего использования.
2. Синтез субмикронных частиц лигнина
- Приготовьте водный раствор щелочного лигнина 5 мг/мл, растворив 125 мг щелочного лигнина в 25 мл сверхчистой воды на магнитной мешалке.
- Медленно добавьте 1 мл 96% EtOH в раствор щелочного лигнина.
- Перемешивайте смесь на магнитной мешалке при 500 об/мин в течение 3 мин.
- Приготовьте 50 мл 1% раствора лимонной кислоты, растворив 0,5 г лимонной кислоты в сверхчистой воде до конечного объема 50 мл.
- Добавьте в смесь 7 мл 1% лимонной кислоты по каплям с помощью шприца со скоростью потока примерно 4 мл/мин.
- Продолжайте помешивать смесь в течение 10 минут, когда коричневый прозрачный раствор превратится в мутную светло-коричневую суспензию субмикронных частиц.
- Перенесите суспензию в пробирки и центрифугуйте в течение 30 мин при 15 000 × g в ультрацентрифуге при 10 °C.
- Соберите надосадочную жидкость для дальнейших анализов и промойте микрочастицы сверхчистой водой.
- Повторите процедуры ополаскивания/ультрацентрифугирования 3 раза.
- Перед ультразвуковой гомогенизацией емкость с микрочастицами опустить на ледяную баню.
- Гомогенизируйте микрочастицы ультразвуком в течение двух циклов по 4 мин каждый с интенсивностью 96% в ультразвуковом гомогенизаторе.
- Охладите емкости в течение 1 минуты после первого цикла.
- Лиофилизируйте микрочастицы при температуре -64 °C в сублимационной сушилке и храните их в эксикаторе для дальнейшего использования.
3. Синтез микро-/субмикронных частиц лигнина, инкапсулированных флавоноидами
- Повторите шаги 1.1-1.5 для микрочастиц.
- Взвесьте 0,08 г морина, растворите его в 1 мл EtOH и добавьте этот этаноловый раствор в смесь.
- Перемешивайте смесь на магнитной мешалке при 500 об/мин в течение 20 мин.
- Добавьте в смесь 20 мл 2 Н HNO3 по каплям с помощью шприца со скоростью потока примерно 150 мкл/с.
- Продолжайте помешивать смесь в течение 60 минут.
- Повторите шаги 1.8-1.13.
- Повторите шаг 2.1 для субмикронных частиц.
- Масса 0,04 г кверцетина, растворите его в 1 мл этанола и добавьте этот этанольный раствор в щелочной водный раствор лигнина.
- Перемешивайте смесь на магнитной мешалке при 500 об/мин в течение 10 мин.
- Повторите шаги 2.4-2.13.
4. Определение эффективности инкапсуляции микро-/сумикрочастиц лигнина
- Рассчитать содержание добавляемого биологически активного вещества в ходе процедуры синтеза обоих типов инкапсулированных флавоноидами частиц лигнина.
- Спектрофотометрически определяют поглощение флавоноида в надосадочной жидкости, полученной на этапах 1.9 и 2.8 после разбавления его 96% EtOH.
- Рассчитайте концентрацию незахваченного морина/кверцетина, используя калибровочные кривые флавоноидов.
- Рассчитать эффективность инкапсуляции (EE, %) микрочастиц лигнина по отношению к природным флавоноидам с помощью уравнения (1):
(1)
где wo – общее количество добавленного биологически активного вещества (мг), а wf – количество свободного незахваченного флавоноида (мг). - Рассчитайте загрузочную способность лекарственного средства (DLC, %) — важный параметр, представляющий количество лекарственного препарата в частицах на единицу веса несущей системы — с помощью уравнения (2):
(2)
где wp – общее количество (выход) микро-/субмикронных частиц лигнина, полученных после лиофилизации (мг).
(1)
(2)5. Характеристика микро- и субмикронных частиц лигнина
- Определение количества, размера и распределения частиц по размерам
- Оцените размер частиц и распределение частиц в образцах с помощью автоматического счетчика ячеек с возможностью подсчета гранул. Добавьте с помощью микропипетки 1 мкл суспензии микро-/субмикронных частиц лигнина/флавоноидов в сверхчистую воду в лунку счетного стекла, необходимую для операции.
- Дождитесь, пока количество частиц в 1 мл суспензии, а также их количество и распределение по размерам отобразятся на дисплее автоматического счетчика клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство позволяет хранить данные на флэш-памяти USB. Специальное программное обеспечение автоматического счетчика ячеек позволяет осуществлять дальнейшую обработку сохраненных цифровых и фотофайлов.
- Определение содержания поверхностных кислотно-основных групп частиц лигнина методом потенциометрического титрования
- Масса 0,04 г незагруженных/инкапсулированных флавоноидами частиц лигнина.
- Переложите их в колбу Эрленмейера, добавьте 10 мл 0,1 М HCl и поместите колбу на магнитную мешалку при 250 об/мин.
- Наполните 50 мл бюретки 0,1 М стандартным раствором титранта NaOH.
- Перед началом титрования измерьте исходный pH раствора в колбе Эрленмейера настольным рН-метром.
- Начните титрование и измерьте рН анализируемого раствора после каждых 0,5 мл добавленной порции титранта.
- Сохраните экспериментальные данные в таблице, содержащей объем примененного титранта и соответствующее значение pH.
- Прекратите титрование при достижении приблизительно постоянного значения рН, увеличив объем раствора титранта.
- Построение экспериментальных данных в виде кривых дифференциального титрования с нулевыми, первыми и вторыми производными.
- Определите эквивалентные точки и соответствующие эквивалентные объемы используемых титрантов.
- Рассчитать содержание кислотных основных групп А, аи А, bна поверхности незагруженных и загруженных флавоноидами частиц лигнина с помощью уравнений (3) и (4):
, мгэкв/г (3)
мгэкв/г (4)
где Veqi — эквивалентный объем (мл); NT нормальность титранта (мгекв/мл); V T объем титранта, используемого для процедуры определения (мл); m вес анализируемого образца (г).
- Определение точки нулевого заряда (рНPZC) частиц на основе лигнина методом добавления твердых веществ.
- Приготовьте 60 мл 0,1 М водного раствора NaCl.
- Добавьте 9 мл 0,1 М раствора NaCl в каждую из пяти конических колб с пробками и отрегулируйте рН до рНi = 2, 4, 7, 10 и 12 (где i = 1-5 обозначают номер соответствующего раствора), соответственно путем добавления 0,1 М HCl или 0,1 М NaOH. Общий объем раствора в каждой колбе довести до 10 мл точно, добавив раствор NaCl той же крепости.
- Добавьте 40 мг сухих частиц лигнина (разгруженных, наполненных флавоноидами микро/субмикронов) в каждую колбу и надежно закройте колбы.
- Закрепите колбы вертикально на орбитальном вибростенде и удерживайте их в течение 24 часов.
- Дайте уравновеситься в течение 30 минут и затем измерьте конечный pH (pHf) надосадочной жидкости в каждой колбе.
- Сравните значения pHf с соответствующими начальными значениями pH (pHi).
- Точка нулевого заряда (pHPZC) определяется как значение pH, при котором кривая ΔpH в зависимости от pHi пересекает прямую с координатами (pHi; pHi).
- Определение общего содержания фенольных соединений (ТФК) частиц лигнина
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее содержание фенольных соединений (TPC) микро-/субмикронных частиц лигнина определяется модифицированным колориметрическим методом Фолина-Чокальтеу.- Смешать 200 мкл водной суспензии частиц с концентрацией 500 мкг/мл с 600 мкл сверхчистой воды и 200 мкл реагента Фолина-Чокальтеу (1:1, v/v).
- Через 5 мин добавить в смесь 1,0 мл 8%Na2CO3 и 1,0 мл воды Milli-Q и инкубировать ее в темноте при 40 °C в течение 30 мин на водяной бане с прерывистым перемешиванием.
- Центрифугируйте суспензию при 5 300 × г в течение 2 мин.
- Подготовьте заготовку, не содержащую частиц.
- Перенесите 3,5 мл надосадочной жидкости в кварцевую кювету толщиной 10 мм и измерьте поглощение на УФ/ВИД спектрофотометре в видимой области на длине волны 760 нм относительно бланка.
- Подготовить калибровочную кривую стандартной галловой кислоты в соответствии с этапами 5.3.1-5.3.5; только вместо 200 мкл суспензии частиц лигнина используют этанольный раствор галловой кислоты с исходными концентрациями 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 и 200 мкг/мл.
- Выразите экспериментальные данные микрочастиц в мг эквивалента галловой кислоты в миллиграммах на грамм сухого образца (мг ГАЕ/г).
- Рассчитайте TPC с помощью уравнения (5):
мг ГАЕ/г (5)
где CGA - концентрация образца, эквивалентная концентрации стандартной галловой кислоты, полученной на калибровочном графике кислоты (μг GA/мл); Cs — концентрация образца, равная массе сухого образца, деленной на объем растворителя (μг/мл).
, мгэкв/г (3)
мгэкв/г (4)
мг ГАЕ/г (5)6. Определение способности частиц лигнина к высвобождению in vitro
- Приготовьте 250 мл смоделированной бесферментной желудочной среды, регулируя рН стандартного раствора PBS с 0,1 М HCl до рН = 1,2.
- Приготовьте по 250 мл каждого из двух смоделированных растворов кишечной жидкости, регулируя рН стандартного раствора PBS с 0,1 М NaOH/0,1 М HCl до рН = 6,8 и 7,4 соответственно.
- Добавить 25 мг инкапсулированных флавоноидами микро-/субмикронных частиц к 50 мл имитируемой бесферментной желудочной среды в стеклянном реакторе, снабженном механической мешалкой, и поместить его в водяную баню при постоянной температуре T = 37 ± 0,2 °С.
- Опустите мешалку на глубину 2/3 объема жидкости, чтобы обеспечить полное смешивание твердой и жидкой фаз и обеспечить максимальный массоперенос без застойных зон.
- Вынимайте 1 мл пробы из реактора каждые 10 мин до90-й минуты и немедленно пипетируйте 1 мл свежего раствора моделируемой жидкости в реактор, чтобы предотвратить изменение общего объема и обеспечить условия погружения.
- Повторите ту же процедуру, включая шаги 6.3-6.6, с обоими смоделированными растворами кишечной жидкости с рН = 6,8 и 7,4 соответственно в течение 200 мин.
- Провести аналогичные эксперименты с незагруженными частицами лигнина в трех имитируемых средах и использовать образцы в качестве заготовок для обнуления спектрофотометра.
- Определить поглощение образцов спектрофотометрическим путем после фильтрации образцов и разбавления их 96% EtOH по сравнению с холостыми образцами из шага 6.7 и рассчитать соответствующую концентрацию флавоноидов с использованием соответствующих калибровочных кривых морина, полученных при рН = 1,2, 6,8 и 7,4 соответственно.
- Рассчитать кумулятивное высвобождение (CR) биофлавоноидов с помощью уравнения (6) в μг/мл и процент кумулятивного высвобождения (CRP) по уравнению (7):
(6)
где Ci и Ci+1 – концентрации морина/кверцетинав i и (i+1)м образцах (μг/мл); Vs объем пробы, отобранной из реактора периодического действия (мл); V общий объем моделируемой среды (мл).
(7)
ГдеCmax — максимальная концентрация биологически активного соединения в носителе (μг/мл).
(6)
(7)7. Статистический анализ
- Выразите экспериментальные данные в виде средств ± стандартных отклонений (SD) трех независимых измерений.
- Определите статистическую значимость экспериментальных результатов, выполнив тест ANOVA в качестве апостериорного теста. Рассмотрим значение p < 0,05 статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для получения микро-/субмикронных частиц щелочного лигнина был применен метод осаждения против растворителей. Водный раствор разбавленной неорганической кислоты-азотной кислоты/органической кислоты-лимонной кислоты диспергировали в водный раствор щелочного лигнина, обогащенный экологически чистым поверхностно-активным веществом/этанолом, что приводило к постепенному осаждению растворенного вещества биополимера и после обработки ультразвуком получалась суспензия компактных микро-/субмикронных частиц (рис. 1).
Рисунок 1: Гомогенизация частиц лигнина. (A) Ультразвуковая гомогенизация синтезированных субмикронных частиц лигнина; (В) Гомогенизированные микрочастицы лигнина, загруженные и выгруженные морином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Определяли размер, количество и распределение по размерам незагруженных и инкапсулированных морином микроносителей лигнина (рис. 2). Экспериментальные данные показали более высокую концентрацию, 1 × 107 частиц/мл (2 037 частиц/мкл) и более высокий средний размер (6,1 мкм) микроносителей, загруженных биофлавоноидами (рис. 2B), чем незагруженных с концентрацией 7,4 ×10 6 частиц/мл (1 474 частиц/мкл) и средним размером 5,7 мкм (рис. 2A). Процентное распределение по размерам обоих типов частиц в диапазоне размеров 3-6 мкм составило 75,2% для незагруженных и 69,3% для микроносителей, инкапсулированных морином, и 20,2% и 25,2% соответственно в диапазоне 7-10 мкм. Количество, концентрация и скорость потока антирастворителя, азотной кислоты, имеют важное значение для размера частиц. Более высокая концентрация и большее количество кислоты приводит к более крупным частицам, в то время как более высокая скорость потока провоцирует агрегацию суспензии.
Рисунок 2: Распределение частиц по размерам. (A) Фактическое распределение по размерам незагруженных микрочастиц лигнина в 1 мкл суспензионного программного обеспечения счетчика частиц; (В) фактическое распределение по размерам инкапсулированных морином микрочастиц щелочного лигнина в 1 мкл суспензионного программного обеспечения счетчика частиц. С) микроскопическая фотография распределения незагруженных микрочастиц лигнина с помощью счетчика частиц; (D) микроскопическая фотография распределения микрочастиц щелочного лигнина, инкапсулированных морином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 3 представлены спектры поглощения УФ/ВИД растворов этанола морина, водных растворов щелочного лигнина и смесей, содержащих морин и лигнин с различными начальными концентрациями. Очевидно, что пики поглощения чистого лигнина и биофлавоноида не совпадают и гетерополимер не оказывает разрушающего влияния при применении спектрофотометрического метода определения концентрации морина в жидкой фазе после инкапсуляции флавоноида в полимерные микроносители и в экспериментах по высвобождению in vitro . Максимальное поглощение морина в двухкомпонентной смеси сместилось на более высокую длину волны, от λmax = 359 нм до λmax = 395 нм, в результате повышения рН среды из-за присутствия щелочного лигнина. Последнее отклонение максимума поглощения в видимой области спровоцировало необходимость построения калибровочных кривых морина при различных значениях рН среды (рис. 4А). Три стандартные кривые, характеризующиеся очень сильными линейными корреляциями, были подтверждены высокими значениями коэффициентов регрессии (R2 > 0,99) в диапазоне концентраций морина Co = 2,5-100 мкг/мл. Аналогичным образом, три стандартные кривые кверцетина в трех смоделированных физиологических компартментах, представленные на рисунке 4B, показали высокую линейность в одном и том же диапазоне концентраций.
Рисунок 3: Сравнение УФ/ВИД спектров этанольных растворов морина, водных растворов щелочного лигнина и смесей, содержащих морин и лигнин с различными начальными концентрациями. Спектры чистого лигнина и морина не совпадают, и гетерополимер не оказывает никакого разрушительного влияния. Добавление лигнина к морину приводит к смещению максимального поглощения морина на более высокую длину волны, от λmax = 359 нм до λmax = 395 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Калибровочные кривые растворов этанольных флавоноидов. (А) Морин и (В) кверцетин в диапазоне концентраций Co = 2,5-100 мкг/мл при рН = 1,2 (синий) (соответствует смоделированной желудочной жидкости), рН = 6,8 (красный) (соответствует смоделированной жидкости в тонком кишечнике) и рН = 7,4 (зеленый) (соответствует смоделированной жидкости толстой кишки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Относительную концентрацию кислых и основных активных центров/функциональных групп на поверхности загруженных и загруженных частиц щелочного лигнина определяли методом потенциометрического титрования. Расчеты были основаны на эквивалентных объемах титранта, определенных по кривым дифференциального титрования второй производной (рис. 5). Значения определяемого pKa, концентрации кислых (сильных, слабых, общих) функциональных групп, рН и рНpzc микро- и субмикронных частиц представлены в таблице 1.
Иллюстрация 5: Кривые дифференциального потенциометрического титрования второй производной микро-/субмикронных частиц лигнина.
| Параметр | микрочастицы лигнина | Микрочастицы лигнина, инкапсулированные морином | субмикронные частицы лигнина | субмикронные частицы лигнина, инкапсулированные кверцетином |
| Vэкв., мл | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (сильный), мгэк/г | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (слабый), мгэк/г | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (всего), мгэк/г | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (водная суспензия) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| рН pzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Таблица 1: Значения эквивалентного объема титранта (Vэкв.), отрицательного основания -10 логарифма константы кислотной диссоциации (pKa), концентраций кислых (сильных, слабых, общих) функциональных групп (Aa, mgeq/g), рН и точки нулевого заряда (рНpzc) нагруженных и загруженных микро- и субмикронных частиц лигнина. Микро- и субмикронные, незагруженные и флавоноидные частицы лигнина заряжены отрицательно, потому что их pH > pHpzc.
Общее содержание фенолов (ТПК), определенное модифицированным колориметрическим методом Фолина-Чокальтеу и рассчитанное в эквиваленте галловой кислоты, составило 78,2 мг ГАЕ/г незагруженных частиц лигнина, в то время как значение ТПК инкапсулированных морином микроносителей с той же концентрацией было в 2,3 раза выше (183,43 мг ГАЕ/г). Последнее указывает на то, что частицы гетеробиополимера обогащены дополнительными фенольными группами за счет включения молекул флавоноидов. Эффективность инкапсуляции флавоноидов составила: 98,1% для морина и 97,6% для кверцетина. Инкапсулирующая способность препарата составила 28,2% для микрочастиц, загруженных морином, и 39,0% для субмикронных частиц, инкапсулированных кверцетином.
Кумулятивное высвобождение морина и кверцетина in vitro исследовали в смоделированных желудочно-кишечных средах, свободных от ферментов: желудочной, мелкокишечной и толстой кишке при рН = 1,2, 6,8 и 7,4 соответственно (рис. 6). Наибольшая эффективность высвобождения около 24% была достигнута через 30-40 мин при рН = 6,8. Согласно экспериментальным результатам, количество высвобожденного флавоноида в смоделированной среде тонкого кишечника преобладало в два раза больше, чем в смоделированной среде толстой кишки, и в три раза превышало эффективность высвобождения, определенную в желудке. Наибольшая степень высвобождения кверцетина, установленная в SIF при рН = 7,4 на 70-90мин, составила 34%, что превысило кумулятивное высвобождение флавоноида в SGF (рН = 1,2) и SIF (рН = 6,8) на 23,5% и 18% соответственно.
Рисунок 6: Сравнительный анализ кумулятивной эффективности высвобождения in vitro морина и кверцетина из микро- и субмикронных частиц лигнина в смоделированных физиологических средах. Наибольшая степень высвобождения морина была достигнута в смоделированной тонкой кишечной среде. Наибольшая эффективность высвобождения кверцетина была зарегистрирована в смоделированной жидкости толстой кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
К числу основных критических вопросов современных методик синтеза для разработки лекарственных препаратов-носителей на основе биополимеров относится применение опасных органических реагентов – летучих и легковоспламеняющихся растворителей, таких как тетрагидрофуран, ацетон, метанол и даже ДМСО в высоких концентрациях, что ограничивает их применимость в биомедицине, фармацевтической промышленности, пищевых технологиях из-за проявления возможных токсическихэффектов20, 21,22,23,24. Еще одним важным моментом является участие в процедуре синтеза сложных химических реакций (например, этерификация, полимеризация) или дорогостоящих аппаратов. Оба метода, представленные в настоящей рукописи, преодолевают последние ограничения за счет использования альтернативных растворителей (вода) и нетоксичных соединений, таких как поверхностно-активные вещества (Tween 80) и сшивающие агенты (этанол, лимонная кислота), классифицируя их как «зеленые» методы синтеза. Кроме того, методики предлагают решение, удовлетворяющее критическую потребность и потребность в разработке недорогих, экологически чистых, устойчивых процедур для проектирования частиц лигнина, служащих биоразлагаемыми, биологически активными и биосовместимыми шаблонами-носителями физиологически активных веществ25.
Для получения частиц лигнина желаемого размера были выбраны два условия производства: один с высокой концентрацией лигнина (50 г/л) и азотной кислоты в качестве антирастворителя, а другой с более низкой концентрацией лигнина (5 г/л), этанол в качестве антирастворителя и лимонная кислота, играющая одновременно двойную роль антирастворителя и сшивающего агента, поскольку именно эти две переменные влияют на размер частиц лигнина. Скорость потока во время обеих процедур поддерживалась на низком уровне, чтобы обеспечить более мелкие частицы и предотвратить их агрегацию. Есть несколько критических моментов, которые необходимо учитывать при выборе неорганических и органических кислот для протоколов синтеза.
Азотная кислота была выбрана потому, что она является сильной неорганической кислотой, которая обеспечивает высокую степень осаждения щелочного лигнина, и при контроле скорости ее добавления можно получить частицы в желаемом диапазоне размеров. Кроме того, ожидается, что добавлениеHNO3 может обеспечить модификацию гетерополимерных частиц за счет вероятных химических изменений структуры лигнина, связанных с: процессами реакций нитрирования-замещения атомов Н в бензольных кольцах с -NO2-группами ; этерификация алифатических -ОН-групп и формирование сложных функциональных групп; и/или окисление фенольных -OH и -OCH3 групп, приводящее к образованию хиноновых структур. Что касается роли осадителя и концентрации лигнина на размер синтезируемых частиц, то, с одной стороны, более высокая начальная концентрация лигнина в сочетании с добавлением сильной азотной кислоты (pK a = -1,4) и ограниченная растворимость щелочного гетерополимера в неорганической кислоте приводили к образованию частиц в микрометровом диапазоне. С другой стороны, добавление этанола в водный раствор щелочного лигнина с меньшей концентрацией провоцирует образование мелкодисперсной суспензии из-за частичной растворимости щелочного лигнина в спирте. Более того, последующее добавление лимонной кислоты привело к образованию частиц в нанометровом диапазоне, потому что органическая кислота слабее (pKa1 = 3,13), чем азотная кислота, следовательно, предлагает меньшую протяженность осадков.
Некоторыми основными свойствами наноразмерных фармацевтических препаратов являются циркуляция лекарств, высвобождение лекарств из лекарственных форм в определенных местах и всасывание через биологические мембраны. На эти свойства в значительной степени влияют некоторые физико-химические характеристики носителей наночастиц и инкапсулированные молекулы лекарственного средства.
Физико-химические характеристики носителей биополимеров: концентрация поверхностно-активных кислотных и основных групп, точка нулевого заряда (рНPZC), размер, гранулометрический состав, а также спектральные характеристики частиц до и после включения биологически активного вещества, являются существенными параметрами, которые необходимо учитывать при оценке функциональных групп, реакционной способности, стабильность и однородность частиц10.
Размер частиц, распределение частиц по размерам, заряд и морфология являются одними из основных факторов, влияющих на эти оценки. Размер частиц влияет на их стабильность, реакционную способность и поведение по высвобождению лекарств26. Более мелкие частицы предлагают большую площадь массопереноса, что приводит к более высокой скорости высвобождения лекарств. Напротив, меньшая площадь поверхности массопереноса более крупных частиц приводит к более низкой скорости диффузии лекарственного препарата внутри этих частиц.
Применение титриметрических методов в качестве основных методов определения кислотных и основных участков и функциональных групп, присутствующих на твердых поверхностях, постоянно расширяется. К основным преимуществам потенциометрического титрования можно отнести экономию времени и труда, высокую точность, а также отказ от стандартных образцов и дорогостоящего оборудования. Метод был применен в настоящем исследовании, так как он позволяет охарактеризовать биополимерные частицы путем качественного и полуколичественного определения природы и количества активных центров, присутствующих на поверхности загруженных и незагруженных носителей биополимеров27.
Поверхностный заряд биологических и медицинских микро-/нано-носителей играет важную роль в клеточном поглощении28. pHPZC соответствует нулевой плотности поверхностного заряда, то есть эквивалентным количествам отрицательных и положительных зарядов, образующихся в результате протонного равновесия. Определение этих значений дает информацию о специфичности адсорбции29. Однако, поскольку параметр изоэлектрическая точка представляет только внешние поверхностные заряды частиц во взвешенном состоянии, в то время как точка нулевого заряда изменяется в зависимости от общего суммарного поверхностного заряда (внешнего и внутреннего) частиц, протокол pHpzc был впервые применен в настоящем исследовании в качестве простого и эффективного метода для характеристики биополимерных носителей лекарственных средств. Согласно концепции pHpzc, при pH выше pHpzc поверхность частиц биополимера преимущественно отрицательно заряжена, в то время как суммарный положительный заряд наблюдается, когда pH суспензии ниже pHpzc. Из экспериментальных данных, представленных в таблице 1, можно сделать вывод, что микро- и субмикронные, незагруженные и загруженные флавоноидами частицы лигнина заряжены отрицательно, поскольку их рН >рН pzc.
На эффективность загрузки флавоноидов влияет эффективность инкапсуляции и способность загрузки лекарственного средства. Эффективность инкапсуляции (E, %) определяется как отношение количества лекарственного средства, содержащегося в частицах, к общему количеству в композиции. На эффективность инкапсуляции влияют характеристики лекарственного средства, растворителя и носителя30.
Однако эффективная доставка физиологически активного вещества зависит от способа и степени высвобождения его молекул из матрицы-носителя. Таким образом, очень важно учитывать механизм высвобождения препарата и скорость высвобождения 31,32,33. Выясняя механизм высвобождения in vitro биофлавоноидов из их биополимерных микро-/наноносителей, можно моделировать и предсказывать поведение флавоноида и носителя в реальной физиологической среде и оптимизировать дизайн фармацевтических препаратов с улучшенной биодоступностью. Экспериментальные результаты in vitro, полученные в этом исследовании, полезны для клинической практики, поскольку они доказывают, что из-за меньшей степени высвобождения морина/кверцетина из субмикрона лигнина и микрочастиц в желудочной среде инновационные биополимерные частицы пригодны для перорального приема из-за более низкого риска раздражения желудка по сравнению с прямым пероральным приемом биологически активных веществ. Инновационные биополимерные микрочастицы подходят для перорального приема из-за более низкого риска раздражения желудка по сравнению с прямым пероральным приемом биологически активных веществ. Кроме того, субмикронные частицы, благодаря их малому размеру и значительному потенциалу высвобождения, могут применяться в качестве инъекционных составов. Кроме того, новые микро- и субмикронные носители лигнина дают возможность преодолеть ограничения, о которых сообщают другие ученые, связанные с трудностями, связанными с пероральным введением высоких доз некоторых биофлавоноидов, возникающих из-за их склонности образовывать насыщенные растворы в кишечном тракте, что, в свою очередь, препятствует процессу растворения и их эффективной резорбции.
Простота синтеза, биосовместимость получаемых частиц, а также возможность адаптации к текущему протоколу являются основными преимуществами представленной методологии. Размер частиц оптимален для их предполагаемого применения, обеспечивая достаточную площадь поверхности для насадки терапевтических средств и целевых групп, что, в свою очередь, не требует введения большего количества частиц для достижения целевых требований к дозировке. Использование лигнина в качестве основной гетерополимерной матрицы для синтеза инновационных частиц позволяет повысить биосовместимость и предлагает различные активные функциональные группы, предоставляя возможности для индивидуализации частиц для различных применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Болгарским научным фондом по контракту No KΠ-06 H59/3 и научным проектом No 07/2023 FVM, Университет Тракия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
