توليد وتحليل المصب للنسخ أحادي الخلية وأحادي النوى في عضويات الدماغ
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد وتحليل المصب لعضويات الدماغ البشري باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة.
Abstract
على مدى العقد الماضي ، تطورت النسخ أحادية الخلية بشكل كبير وأصبحت طريقة مختبرية قياسية للتحليل المتزامن لملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الفردية ، مما يسمح بالتقاط التنوع الخلوي. من أجل التغلب على القيود التي تفرضها أنواع الخلايا التي يصعب عزلها ، يمكن استخدام نهج بديل يهدف إلى استعادة النوى المفردة بدلا من الخلايا السليمة للتسلسل ، مما يجعل التنميط النسخي للخلايا الفردية قابلا للتطبيق عالميا. أصبحت هذه التقنيات حجر الزاوية في دراسة عضويات الدماغ ، وتأسيسها كنماذج للدماغ البشري النامي. من خلال الاستفادة من إمكانات النسخ أحادية الخلية والنواة المفردة في أبحاث الأعضاء في الدماغ ، يقدم هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة يشمل الإجراءات الرئيسية مثل تفكك الأعضاء ، وعزل الخلية الواحدة أو النوى ، وإعداد المكتبة والتسلسل. من خلال تنفيذ هذه الأساليب البديلة ، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات بيانات عالية الجودة ، مما يتيح تحديد أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية ، وملامح التعبير الجيني ، ومسارات نسب الخلايا. هذا يسهل التحقيقات الشاملة في العمليات الخلوية والآليات الجزيئية التي تشكل نمو الدماغ.
Introduction
على مدى السنوات الماضية ، ظهرت تقنيات الأعضاء كأداة واعدة لزراعة الأنسجة الشبيهةبالأعضاء 1،2،3. خاصة بالنسبة للأعضاء التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل الدماغ البشري ، توفر الكائنات العضوية الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التطور ومظاهر المرض4. على هذا النحو ، تم استخدام عضويات الدماغ على نطاق واسع كنموذج تجريبي للتحقيق في اضطرابات الدماغ البشرية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنموية أو النفسية أو حتى الأمراض التنكسية العصبية4،5،6.
مع ظهور تقنيات التنميط بالنسخ أحادية الخلية ، يمكن دراسة الأنسجة البشرية الأولية والنماذج المعقدة في المختبر بمستوى غير مسبوق من الدقة ، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول تغيرات التعبير الجيني على مستوى المجموعات السكانية الفرعية للخلايا في الصحة والمرض والإبلاغ عن الأهداف العلاجية المفترضة الجديدة7،8،9. تقدم مجال العضوي من خلال استخدام التنميط النسخي أحادي الخلية لتقييم التركيب الخلوي وقابلية التكاثر ودقة تقنيات الدماغ العضوية10،11،12. مكن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) من تصنيف الخلايا وتحديد عدم التنظيم الجيني في الكائنات العضوية المريضة13,14. الأهم من ذلك ، هو تعقيد الأنسجة العضوية التي تستلزم تنفيذ التقنيات التي تمكن من تنميط الخلايا الفردية. يؤدي توصيف المواد العضوية باستخدام طرق مثل التنميط بالنسخ السائب (تسلسل الحمض النووي الريبي السائب) إلى عدم تجانس خلوي مقنع وملامح التعبير الجيني التي يتم حسابها في المتوسط عبر جميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة المعقدة ، مما يحد في النهاية من فهمنا للعمليات الجارية أثناء تطور الأعضاء في الصحة والمرض15،16،17. مع استمرار تقدم طرق scRNA-seq ، يتم إنشاء عدد متزايد من الأطالس ، ويتجلى ذلك في موارد مثل أطلس ألين للدماغ أو أطلس الخلية المفردة لعضويات الدماغ البشري بواسطة Uzquiano et al.18.
يعتمد تحقيق scRNA-seq الناجح من عضويات الدماغ على العزلة الفعالة والتقاط الخلايا السليمة. نظرا لأن تفكك عضويات الدماغ للحصول على خلايا فردية يعتمد على الهضم الأنزيمي ، فإنه يمكن أن يؤثر على أنماط التعبير الجيني عن طريق إحداث الإجهاد وتلف الخلايا19,20. وبالتالي ، فإن تفكك الأنسجة إلى خلايا فردية هو الخطوة الأكثر أهمية. النهج البديل هو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ، والذي يسهل استخراج النوى الخالية من الإنزيم من الأنسجة الطازجة والمجمدة21,22. ومع ذلك ، فإن عزل النوى عن الأنسجة يطرح تحديات أخرى مثل إثراء أنواع الخلايا ذات الأهمية وانخفاض محتوى الحمض النووي الريبي للنوى مقارنة بالخلايا.
عادة ما يتم إجراء دراسات Transcriptome لعضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq10،18،23. ومع ذلك ، قد يوفر عزل النوى المفردة طريقة متعامدة وتكميلية للتحقق من المظهر النسخي للعضويات. هنا ، نقدم صندوق أدوات ل scRNA- و snRNA-seq لعضويات الدماغ ونناقش النقاط الحرجة للحصول على أفضل بيانات التسلسل جودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
برز التحليل النسخي للخلايا المفردة والنوى المفردة كأداة محورية لفهم الآليات التنظيمية الجينية داخل الأنسجة المعقدة. كلتا الطريقتين تمكن من دراسات النسخ من عضويات الدماغ. لضمان تجربة ناجحة بشكل عام ، تكون جودة المواد الأولية ذات أهمية عالية. لذلك ، من الضروري قطع المواد العضوية بانتظام ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فاليريا فرنانديز فالون على التعليمات الأصلية لمجموعة Miltenyi Neural Disdisation. نشكر أيضا منصة تكنولوجيا الجينوم الخاصة ب Max Delbrueck Centrum على توفير وصفة المخزن المؤقت للتحلل NP40 والمشورة القيمة لإعداد هذا البروتوكول. كما نشكر مارغريتا هيرتسوغ وألكسندرا تشيرنيشيف على الدعم التنظيمي للمختبر.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
References
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
- Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
- Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
- Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
- Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
- Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
- Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
- Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
- Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
- Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).
