Generation and Downstream Analysis of single-cell and single-nuclei transcriptomes in brain organoids(뇌 오가노이드에서 단세포 및 단핵체 전사체의 생성 및 다운스트림 분석)
Summary
여기에서는 single-cell 및 single-nucleus RNA sequencing을 사용하여 인간 뇌 오가노이드의 생성 및 다운스트림 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 소개합니다.
Abstract
지난 10년 동안 단세포 전사체학은 크게 발전하여 개별 세포의 유전자 발현 프로파일을 동시에 분석하기 위한 표준 실험실 방법이 되어 세포 다양성을 포착할 수 있게 되었습니다. 분리하기 어려운 세포 유형으로 인한 한계를 극복하기 위해 온전한 세포 대신 단일 핵을 회수하는 것을 목표로 하는 대체 접근 방식을 염기서열 분석에 활용하여 개별 세포의 전사체 프로파일링을 보편적으로 적용할 수 있습니다. 이러한 기술은 뇌 오가노이드 연구의 초석이 되었으며, 발달 중인 인간 뇌의 모델로 자리 잡았습니다. 뇌 오가노이드 연구에서 단세포 및 단핵 전사체학의 잠재력을 활용하는 이 프로토콜은 오가노이드 해리, 단세포 또는 핵 분리, 라이브러리 준비 및 염기서열분석과 같은 주요 절차를 포괄하는 단계별 가이드를 제공합니다. 이러한 대체 접근법을 구현함으로써 연구자들은 고품질 데이터 세트를 얻을 수 있으며, 이를 통해 신경 세포 및 비신경 세포 유형, 유전자 발현 프로필 및 세포 계통 궤적을 식별할 수 있습니다. 이를 통해 뇌 발달을 형성하는 세포 과정과 분자 메커니즘에 대한 포괄적인 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
Introduction
지난 몇 년 동안 오가노이드 기술은 장기 유사 조직 1,2,3을 배양하는 유망한 도구로 부상했습니다. 특히 인간의 뇌와 같이 쉽게 접근할 수 없는 장기의 경우, 오가노이드는 발병 및 질병 발현에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 기회를 제공합니다4. 따라서 뇌 오가노이드는 발달, 정신 질환 또는 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 인간 뇌 질환을 조사하기 위한 실험 모델로 널리 사용되어 왔습니다 4,5,6.
단세포 전사체 프로파일링 기술의 출현으로 1차 인체 조직 및 복잡한 in vitro 모델을 전례 없는 수준의 세밀성으로 연구할 수 있게 되었으며, 건강 및 질병의 세포 하위 집단 수준에서 유전자 발현 변화에 대한 기계론적 통찰력을 제공하고 새로운 추정 치료 표적에 대한 정보를 제공할 수 있었습니다 7,8,9. 오가노이드 분야는 세포 구성, 재현성 및 뇌 오가노이드 기술의 충실도를 평가하기 위해 단일 세포 전사체 프로파일링을 활용하여 발전해 왔습니다 10,11,12. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 분류 및 병든 오가노이드에서 유전적 조절 장애를 식별할 수 있게 했습니다13,14. 중요한 것은 오가노이드 조직의 복잡성으로 인해 개별 세포의 프로파일링을 가능하게 하는 기술의 구현이 필요하다는 것입니다. 벌크 전사체 프로파일링(벌크 RNA 염기서열분석)과 같은 방법을 사용한 오가노이드의 특성 분석은 복잡한 조직 내의 모든 유형의 세포에서 평균화된 마스킹된 세포 이질성 및 유전자 발현 프로파일로 이어지며, 궁극적으로 건강 및 질병에서 오가노이드 발달 중 진행 과정에 대한 이해를 제한합니다 15,16,17 . scRNA-seq 방법이 계속 발전함에 따라 Allen Brain Atlas 또는 Uzquiano et al.18의 인간 뇌 오가노이드 단세포 아틀라스와 같은 리소스에서 볼 수 있는 아틀라스가 점점 더 많이 생성되고 있습니다.
뇌 오가노이드에서 성공적인 scRNA-seq 달성은 온전한 세포의 효과적인 분리 및 캡처에 달려 있습니다. 개별 세포를 얻기 위한 뇌 오가노이드의 해리는 효소 소화를 기반으로 하기 때문에 스트레스와 세포 손상을 유발하여 유전자 발현 패턴에 영향을 미칠 수 있습니다19,20. 따라서 조직을 개별 세포로 해리하는 것이 가장 중요한 단계입니다. 대안적인 접근법은 단일핵 RNA 염기서열분석(snRNA-seq)으로, 신선 및 냉동 조직21,22 모두에서 핵을 효소 없이 추출할 수 있습니다. 그러나 조직에서 핵을 분리하는 것은 관심 세포 유형의 농축 및 세포에 비해 핵의 낮은 RNA 함량과 같은 다른 문제를 제기합니다.
뇌 오가노이드의 전사체 연구는 일반적으로 scRNA-seq10,18,23을 사용하여 수행됩니다. 그러나 단일 핵의 분리는 오가노이드의 전사체 프로필을 조사하기 위한 직교 및 보충 방법을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 뇌 오가노이드에 대한 scRNA 및 snRNA-seq 도구 상자를 소개하고 최고 품질의 염기서열 분석 데이터를 얻기 위한 중요한 사항에 대해 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 세포 및 단일 핵의 전사체 분석은 복잡한 조직 내의 유전자 조절 메커니즘을 이해하기 위한 중추적인 도구로 부상했습니다. 두 방법 모두 뇌 오가노이드의 전사체 연구를 가능하게 합니다. 전반적으로 성공적인 실험을 보장하기 위해서는 출발 물질의 품질이 높은 관련성을 가져야 합니다. 따라서, 괴사성 코어(necrotic core)(26)의 형성을 방지하기 위해 오가노이드를 정기적으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Miltenyi 신경 해리 키트에 대한 원본 지침에 대해 Valeria Fernandez-Vallone에게 감사드립니다. 또한 NP40 용해 완충액에 대한 레시피와 이 프로토콜을 설정하는 데 귀중한 조언을 제공한 Max Delbrueck Centrum의 유전체학 기술 플랫폼에도 감사드립니다. 또한 실험실 조직의 지원을 아끼지 않은 Margareta Herzog와 Alexandra Tschernycheff에게도 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
References
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