Génération et analyse en aval de transcriptomes unicellulaires et mononucléiaux dans des organoïdes cérébraux
Summary
Ici, nous présentons un protocole complet pour la génération et l’analyse en aval d’organoïdes cérébraux humains à l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire et mononucléique.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, la transcriptomique unicellulaire a considérablement évolué et est devenue une méthode de laboratoire standard pour l’analyse simultanée des profils d’expression génique de cellules individuelles, permettant de capturer la diversité cellulaire. Afin de surmonter les limites posées par les types de cellules difficiles à isoler, une approche alternative visant à récupérer des noyaux uniques au lieu de cellules intactes peut être utilisée pour le séquençage, ce qui rend le profilage du transcriptome des cellules individuelles universellement applicable. Ces techniques sont devenues une pierre angulaire dans l’étude des organoïdes cérébraux, les établissant comme des modèles du cerveau humain en développement. Exploitant le potentiel de la transcriptomique unicellulaire et mononucléus dans la recherche sur les organoïdes cérébraux, ce protocole présente un guide étape par étape englobant des procédures clés telles que la dissociation des organoïdes, l’isolement d’une cellule unique ou de noyaux, la préparation de banques et le séquençage. En mettant en œuvre ces approches alternatives, les chercheurs peuvent obtenir des ensembles de données de haute qualité, permettant l’identification de types de cellules neuronales et non neuronales, de profils d’expression génique et de trajectoires de lignées cellulaires. Cela facilite l’étude approfondie des processus cellulaires et des mécanismes moléculaires qui façonnent le développement du cerveau.
Introduction
Au cours des dernières années, les technologies des organoïdes sont apparues comme un outil prometteur pour la culture de tissus semblables à des organes 1,2,3. En particulier pour les organes qui ne sont pas facilement accessibles, comme le cerveau humain, les organoïdes offrent la possibilité d’obtenir des informations sur le développement et la manifestation de la maladie4. En tant que tels, les organoïdes cérébraux ont été largement utilisés comme modèle expérimental pour étudier divers troubles du cerveau humain, y compris les maladies développementales, psychiatriques ou même neurodégénératives 4,5,6.
Avec l’avènement des technologies de profilage du transcriptome unicellulaire, les tissus humains primaires et les modèles in vitro complexes ont pu être étudiés avec un niveau de granularité sans précédent, fournissant des informations mécanistes sur les changements d’expression génique au niveau des sous-populations cellulaires en santé et en maladie et informant sur de nouvelles cibles thérapeutiques présumées 7,8,9. Le domaine des organoïdes a progressé en utilisant le profilage du transcriptome unicellulaire pour évaluer la composition cellulaire, la reproductibilité et la fidélité des technologies organoïdes cérébraux 10,11,12. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a permis la classification cellulaire et l’identification de la dysrégulation génétique chez les organoïdes malades13,14. Il est important de noter que c’est la complexité des tissus organoïdes qui nécessite la mise en œuvre de techniques permettant le profilage de cellules individuelles. La caractérisation des organoïdes à l’aide de méthodes telles que le profilage du transcriptome en vrac (séquençage de l’ARN en vrac) conduit à une hétérogénéité cellulaire masquée et à des profils d’expression génique qui sont moyennés sur tous les types de cellules du tissu complexe, limitant finalement notre compréhension des processus en cours au cours du développement des organoïdes dans la santé et la maladie 15,16,17. Au fur et à mesure que les méthodes de séquençage de l’ARNsc continuent de progresser, un nombre croissant d’atlas sont créés, comme en témoignent des ressources telles que l’Allen Brain Atlas ou l’Atlas unicellulaire des organoïdes du cerveau humain d’Uzquiano et al.18.
La réussite du séquençage de l’ARNsc à partir d’organoïdes cérébraux repose sur l’isolement et la capture efficaces de cellules intactes. Comme la dissociation des organoïdes cérébraux pour obtenir des cellules individuelles est basée sur la digestion enzymatique, elle peut influencer les modèles d’expression génique en induisant le stress et les dommages cellulaires19,20. Par conséquent, la dissociation du tissu en cellules individuelles est l’étape la plus cruciale. Une autre approche est le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq), qui facilite l’extraction sans enzyme des noyaux à partir de tissus, frais et congelés21,22. Cependant, l’isolement des noyaux d’un tissu pose d’autres défis tels que l’enrichissement des types cellulaires d’intérêt et la faible teneur en ARN des noyaux par rapport aux cellules.
Les études du transcriptome des organoïdes cérébraux sont couramment menées à l’aide du scRNA-seq 10,18,23. Cependant, l’isolement de noyaux uniques pourrait fournir une méthode orthogonale et supplémentaire pour étudier le profil transcriptomique des organoïdes. Ici, nous présentons une boîte à outils pour le séquençage de l’ARNsc et de l’ARNns pour les organoïdes cérébraux et discutons des points critiques pour obtenir des données de séquençage de la meilleure qualité.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse transcriptomique de cellules uniques et de noyaux uniques est apparue comme un outil essentiel pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes dans les tissus complexes. Les deux méthodes permettent d’étudier le transcriptome des organoïdes cérébraux. Pour garantir le succès global de l’expérience, la qualité du matériau de départ est d’une grande importance. Par conséquent, il est nécessaire de couper régulièrement les organoïdes pour éviter la formation d’un noyau nécrotiq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Valeria Fernandez-Vallone pour les instructions originales pour le kit de dissociation neuronale Miltenyi. Nous remercions également la plateforme technologique de génomique du Max Delbrueck Centrum pour avoir fourni la recette du tampon de lyse NP40 et de précieux conseils sur la mise en place de ce protocole. Nous remercions également Margareta Herzog et Alexandra Tschernycheff pour le soutien organisationnel du laboratoire.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
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