Summary
Denne protokol beskriver et optimeret 3D neuralt retina induktionssystem, der reducerer vedhæftning og fusion af retinale organoider med høj repeterbarhed og effektivitet.
Abstract
Retinopati er en af hovedårsagerne til blindhed på verdensplan. Undersøgelse af dets patogenese er afgørende for tidlig diagnose og rettidig behandling af retinopati. Desværre hindrer etiske barrierer indsamling af beviser fra mennesker. For nylig har adskillige undersøgelser vist, at humane pluripotente stamceller (PSC'er) kan differentieres til retinale organoider (RO'er) ved hjælp af forskellige induktionsprotokoller, som har et enormt potentiale inden for retinopati til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og stamcellebaserede terapier. Denne undersøgelse beskriver en optimeret induktionsprotokol til generering af neural nethinden (NR), der signifikant reducerer sandsynligheden for vesikulation og fusion, hvilket øger succesraten for produktionen indtil dag 60. Baseret på PSC'ernes evne til selvorganisering efter dissociation kombineret med visse komplementære faktorer kan denne nye metode specifikt drive NR-differentiering. Desuden er tilgangen ukompliceret, omkostningseffektiv, udviser bemærkelsesværdig repeterbarhed og effektivitet, præsenterer opmuntrende udsigter til personaliserede modeller af nethindesygdomme og leverer et rigeligt cellereservoir til applikationer som celleterapi, lægemiddelscreening og genterapitestning.
Introduction
Øjet fungerer som den primære informationskilde blandt menneskelige sanseorganer, hvor nethinden er det vigtigste visuelle sensoriske væv i pattedyrs øjne1. Retinopati står som en af de primære globale årsager til øjensygdomme, hvilket fører til blindhed2. Omkring 2,85 millioner mennesker verden over lider af varierende grader af synsnedsættelse på grund af retinopati3. Derfor er undersøgelse af dets patogenese afgørende for tidlig diagnose og rettidig behandling. De fleste undersøgelser af human retinopati har primært fokuseret på dyremodeller 4,5,6. Den menneskelige nethinde er imidlertid et komplekst, flerlags væv, der omfatter forskellige celletyper. Traditionelle todimensionelle (2D) cellekultur- og dyremodelsystemer undlader typisk trofast at rekapitulere den normale rumlige tidsmæssige udvikling og lægemiddelmetabolisme af den indfødte menneskelige nethinde 7,8.
For nylig har 3D-kulturteknikker udviklet sig til at generere vævslignende organer fra pluripotente stamceller (PSC'er)9,10. Retinale organoider (RO'er) genereret fra humane PSC'er i et 3D-suspensionskultursystem indeholder ikke kun syv retinale celletyper, men udviser også en tydelig stratificeret struktur svarende til den menneskelige nethinden in vivo 11,12,13. Humane PSC-afledte RO'er har vundet popularitet og udbredt tilgængelighed og er i øjeblikket de bedste in vitro-modeller til undersøgelse af udviklingen og sygdommen i den menneskelige nethinde14,15. I løbet af de sidste par årtier har adskillige forskere vist, at humane PSC'er, herunder embryonale stamceller (ESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er), kan differentiere sig til RO'er ved hjælp af forskellige induktionsprotokoller. Disse fremskridt har et enormt potentiale inden for retinopati til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og stamcellebaserede terapier 16,17,18.
Imidlertid er genereringen af neurale nethinden (NR) fra humane pluripotente stamceller (PSC'er) en kompleks, besværlig og tidskrævende proces. Desuden kan batch-til-batch-variationer i vævsorganoider føre til lavere reproducerbarhed af resultater 19,20. Talrige iboende og ydre faktorer kan påvirke udbyttet af retinale organoider (RO'er), såsom antallet eller arten af startceller og brugen af transkriptionsfaktorer og småmolekyleforbindelser 21,22,23. Siden den første humane RO blev genereret af Sasai-laboratoriet11, er der gennem årene blevet foreslået flere ændringer for at forbedre letheden og effektiviteten af induktionsprocessen 13,21,24,25. Desværre er der til dato ikke etableret nogen guldstandardprotokol til generering af RO'er i alle laboratorier. Der er faktisk en vis grad af uoverensstemmelse i RO'er som følge af forskellige induktionsmetoder samt stor variation i ekspressionen af retinale markører og robustheden af deres struktur22,26. Disse problemer kan i alvorlig grad komplicere prøveindsamlingen og fortolkningen af undersøgelsesresultaterne. Derfor er der behov for en mere konsolideret og robust differentieringsprotokol for at maksimere effektiviteten med minimal heterogenitet af RO-generering.
Denne undersøgelse beskriver en optimeret induktionsprotokol baseret på en kombination af Kuwahara et al.12 og Döpper et al.27 med detaljerede instruktioner. Den nye metode reducerer signifikant sandsynligheden for organoid vesikulation og fusion, hvilket øger succesraten for generering af NR. Denne udvikling har et stort løfte om sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og celleterapiapplikationer til nethindesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen og godkendt af den institutionelle etiske komité på det kinesiske PLA General Hospital. WA09 (H9) ESC-linjen blev opnået fra WiCell Research Institute.
1. Fremstilling af kulturmedier og reagens
- Human ESC-kulturmedium og passageopløsning
- Vedligeholdelsesmedium (MM): Klargør 500 ml komplet MM (Basal Medium + 5x supplement; se materialetabel) aseptisk. Optø 5x tilskud ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved 2-8 °C. Forvarm til RT. Rør godt før brug, indtil tilskuddet er fri for uklarhed.
- 1% ekstracellulær matrix (ECM): Brug en forkølet pipetspids og sterile rør til at dispensere 200 μL ECM (se materialetabel) pr. rør på is. Opbevar rørene i en -20 °C fryser. Smelt ECM på is og fortynd med forkølet DMEM / F12 ved 1:100.
- 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: For at forberede 500 ml 0,5 mM EDTA tilsættes 500 μL 0,5 M EDTA og 0,9 g NaCl til 500 ml 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) (se materialetabel). Bland grundigt og opbevar ved 2-8 °C.
- Retinal differentieringsmedium
- Vækstfaktorfrit kemisk defineret medium (gfCDM): Forbered gfCDM ved at kombinere 45% Iscoves modificerede Dulbeccos medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX), 45% skinkes F12-GlutaMAX (F12-Glutamax), 10% knockout serum udskiftning (KSR), 1% kolesterollipidkoncentrat og 450 μM thioglycerol (se tabel over materialer).
- Små molekyleforbindelser
- Y-27632 2HCI: Tilsæt 50 mg Y-27632 pulver til 3,122 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Dispenser og opbevar Y-27632 (se materialetabel) i en koncentration på 50 mM ved -80 °C i 2 år, idet den holdes væk fra lys. Fortynd stammen 2.500 gange (20 μM) til brug, svarende til 0,4 μL Y-27632 pr. ml gfCDM.
- IWR1-endo: Tilsæt 2,4424 ml DMSO for at opløse 10 mg IWR1-endo (se materialetabel) for at opnå en 10 mM stamopløsning. Påhæld alikvoter og opbevar dem ved -80 °C i op til 2 år. Der tilsættes 0,3 μL 10 mM IWR1-endo pr. ml gfCDM for koncentrationen på 3 μM til induktion.
- SB431542: For at forberede 50 mM SB431542 tilsættes 10 mg SB431542 (se materialetabel) til 0,5203 ml DMSO og blandes grundigt. Opbevares ved -80 °C i solvens i højst 2 år. Til fremstilling af SB431542 i en arbejdskoncentration på 10 μM tilsættes 2 μL af 50 mM stamopløsningen til 10 ml gfCDM.
- LDN-193189 2HCI: Opløs 5 mg LDN-193189 2HCl (se materialetabel) i 10,4297 ml DMSO for at få en 1 mM stamopløsning. Opbevares ved -20 °C eller -80 °C (som anbefalet af producenten). Tilsæt 0,1 μL af bestanden til hver 10 ml gfCDM, hvilket resulterer i 100 nM LDN-193189 til induktion.
- Rekombinant humant knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP4): Rekonstitueres ved 50-200 μg/ml i 4 mM HCl (se materialetabel). Opbevares ved 2 °C til 8 °C i 1 måned eller -20 °C i 1 år efter rekonstitution. Udfør induktion af NR ved hjælp af 1,5 nM BMP4.
- Langsigtet NR-kulturmedium
- Retinsyre (RA): Mål 6 mg RA-pulver (se materialetabel) og tilsæt til 3,9941 ml DMSO. Opbevares i delprøver på 5 mM ved -80 °C og anvendes inden for 3 måneder. For at opnå en arbejdskoncentration på 0,5 μM tilsættes 10 μL af masterblandingen til 100 ml neuralt retinadifferentieringsmedium (NRDM). Tilføj lige før brug.
BEMÆRK: Holdes væk fra lys under klargøring og opbevaring. - Taurin: Tilsæt taurin pulver (se materialetabel), der vejer 200 mg til 7,9904 ml DMSO for at opnå en 200 mM stamopløsning. Dispenseres og opbevares ved 2-8 °C. En arbejdskoncentration på 0,1 mM taurin opnås ved tilsætning af 50 μL stamopløsning pr. 100 ml NRDM.
- NRDM: Komponer NRDM med DMEM / F12-GlutaMAX medium, 1% N2 supplement, 10% føtalt bovin serum, 0,5 mM RA og 0,1 mM taurin (se materialetabel). Opbevares ved 2-8 °C i op til 2 uger eller 6 måneder ved -20 °C for at sikre komponenternes aktivitet.
- Retinsyre (RA): Mål 6 mg RA-pulver (se materialetabel) og tilsæt til 3,9941 ml DMSO. Opbevares i delprøver på 5 mM ved -80 °C og anvendes inden for 3 måneder. For at opnå en arbejdskoncentration på 0,5 μM tilsættes 10 μL af masterblandingen til 100 ml neuralt retinadifferentieringsmedium (NRDM). Tilføj lige før brug.
- Blokeringsbuffer: Fortynd 1:9 med DPBS for at opnå en 10% arbejdsløsning til brug (se materialetabel). Opbevares ved -20 °C i op til 5 år.
BEMÆRK: Udfør alle andre procedurer i et klasse II biosikkerhedsskab for at sikre sterilitet, undtagen vejning. Hvis det er nødvendigt at tilføje vejede reagenser under fremstillingsprocessen, skal der anvendes 0,22 μm filtre til filtrering.
2. Dyrkning af H9-ESC
- Optøning af H9-ESC'er
- Tilsæt 1 ml 1% ECM til hver brønd på en 6-brønds plade. Der inkuberes i 1 time i en inkubator ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære.
BEMÆRK: Undgå tilsætning af ECM langs brøndvæggene, da det kan klæbe til overfladen. - Tag en H9-ESC kryoialbestand fra væskenitrogentanken og ryst den hurtigt i 37 °C vand i 30 sekunder.
BEMÆRK: Lad ikke hætteglasset tø helt op. - Fjern hætteglasset og steriliser det forsigtigt med 75% desinfektionsmiddel alkoholspray. Den optøede H9-ESC fra kryovialrøret tilsættes til et 15 ml rør indeholdende 9 ml MM med 10 μM Y-27632.
- Centrifuger glasset ved 190 × g i 5 minutter ved RT. Det meste af supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette på 1 ml, og der efterlades ca. 50 μl supernatant for at undgå celletab.
- Der tilsættes 1 ml MM indeholdende 10 μM Y27632 til cellesedimentet, og cellesedimentet resuspenderes forsigtigt med en 1 ml pipette ved pipettering op og ned 5-10 gange.
- Fjern ECM-belægningen efter 1 times inkubation. Der tilsættes 2 ml forvarmet MM indeholdende 10 μM Y-27632 til hvert hul.
- Dispenser 0,5 ml cellesuspension pr. Hul. Ryst forsigtigt pladen sideværts for at sikre jævn fordeling af cellerne.
- Pladen inkuberes ved 37 °C under 5 % CO2 i mindst 24 timer uden at røre ved den.
- Skift mediet dagligt. Når klontætheden når 70% og derover, kræves passering.
- Tilsæt 1 ml 1% ECM til hver brønd på en 6-brønds plade. Der inkuberes i 1 time i en inkubator ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære.
- Overførsel af H9-ESC'er
- Den ECM-belagte plade klargøres som beskrevet ovenfor (trin 2.1.1), og der tilsættes 2 ml MM pr. hul.
- Fjern det brugte medium fra pladerne med 6 brønde. Vask hver brønd to gange med 1 ml DPBS.
- Hver brønd vaskes to gange ved langsomt at tilsætte 1 ml EDTA og inkubere med 1 ml EDTA i 4-7 minutter ved RT.
BEMÆRK: Under inkubationen undersøges 6-brøndpladen i 3 minutter under et mikroskop. Fortsæt straks til næste trin, hvis de fleste celler er tæt på at løsne sig fra skålen. Undgå lang tid inkubation for at reducere negativ indvirkning på cellerne. - Kassér EDTA og tilsæt 1 ml MM for at afbryde fordøjelsen.
- Bank let på brøndpladen, indtil størstedelen af cellerne er løsnet.
- Overfør forsigtigt cellesuspensionen til et 15 ml centrifugerør med en 5 ml pipette. Resuspender forsigtigt H9-ESC-kolonierne op og ned 3-5 gange for at blande dem med en Pasteur-pitette. Overfør 20-100 μL cellesuspension i en ny ECM-belagt 6-brønds kulturskål og ryst den frem og tilbage.
- Når celletætheden observeres som tilstrækkelig under et mikroskop, inkuberes pladen ved 37 °C under 5% CO2 i mindst 24 timer uden at røre den.
- Skift mediet dagligt. Ved 70% klontæthed og derover kræves passage.
3. Generering af menneskelige NR'er
BEMÆRK: Når kolonierne opnår ca. 70% sammenløb, kan de rettes mod differentiering i retinale organoider (RO'er) ved hjælp af de proceduremæssige trin, der er skitseret i figur 1.
- Dag 0 - Embryoid krop (EB) dannelse
- Efter vask af cellerne med 2 ml DPBS tilsættes 0,5 ml CDS (se materialetabellen) indeholdende 20 μM Y27632 til brønden. Der inkuberes i 3 minutter ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 inkubator.
BEMÆRK: Kontroller under et mikroskop. Reducer inkubationstiden så meget som muligt for at undgå skadelige virkninger på cellerne. - Afbryd fordøjelsen ved tilsætning af 3 ml MM indeholdende 20 μM Y27632. Supernatanten centrifugeres ved 190 × g i 5 min. og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellepillen i 1 ml gfCDM indeholdende 20 μM Y27632, og tæl cellerne. Tilføj det tilsvarende volumen for 1,2 × 106 celler (1,2 × 104 celler pr. Hul) til 10 ml gfCDM, som er præinkorporeret med 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 og 100 nM LDN-193189 (se materialetabel).
- Der tilsættes 100 μL cellesuspension til hvert hul i 96 V-bundede koniske huller. Pladen anbringes i en befugtet 5% CO2 inkubator indtil dag 6.
BEMÆRK: Flyt ikke opvasken i mindst 24 timer for at øge vedhæftningen af EB'er.
- Efter vask af cellerne med 2 ml DPBS tilsættes 0,5 ml CDS (se materialetabellen) indeholdende 20 μM Y27632 til brønden. Der inkuberes i 3 minutter ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 inkubator.
- Dag 6 - Retina induktion
- På dag 6 tilsættes 10 ml gfCDM indeholdende 55 ng/ml BMP4 for at muliggøre en fuldstændig ændring af dyrkningsmediet på EB'erne. Sæt pladen tilbage til inkubatoren.
BEMÆRK: Pipette mod væggene i den 96 V-bundede koniske brønd for at undgå luftbobler. Undgå at optage organoider, når du skifter medium. - Udfør halvmedium skift på dag 9, dag 12 og dag 15. Udskift halvdelen af mediet med frisk gfCDM for gradvist at fortynde BMP4.
- På dag 6 tilsættes 10 ml gfCDM indeholdende 55 ng/ml BMP4 for at muliggøre en fuldstændig ændring af dyrkningsmediet på EB'erne. Sæt pladen tilbage til inkubatoren.
- Dag 18 - Langsigtet NR-kultur
- På dag 18 overføres de dannede EB'er forsigtigt til 15 ml centrifugeglas ved hjælp af 5 ml Pasteur-pipetter og skylles forsigtigt igen med NRDM. Overfør EB'erne til 6-brønds- eller 24-brøndsplader med lav adsorption (se materialetabellen). Sæt pladen tilbage til inkubatoren.
- Udskift mediet med frisk NRDM hver 3. dag.
BEMÆRK: Sluk lyset under medieskiftet, fordi RA er lysfølsom. Fjern dårligt differentierede organoider, og adskil klæbende organoider under et mikroskop.
4. Analyse af menneskelige NR'er
- Montering af RO'erne
- Vælg forskellige generationer af H9-ESC for at inducere tre batcher RO'er.
BEMÆRK: Tre plader med antallet af dannende NR'er for hver af de tre vurderede metoder (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 og den modificerede metode i denne undersøgelse) beregnes for at vurdere induktionssuccesraten. Induktion betragtes som vellykket, hvis lysmikroskopi afslører dannelsen af neuroepitellignende strukturer på dag 30.
- Vælg forskellige generationer af H9-ESC for at inducere tre batcher RO'er.
- Immunofluorescerende farvning af RO'er
- Overfør 3-5 RO'er til 1,5 ml rør. Afpipetter overskydende medium og vask RO'erne en gang med 1 ml DPBS ved RT. Lad RO'erne synke, og fjern forsigtigt DPBS. Tilsæt 1 ml 4% paraformaldehyd (se materialetabel) pr. 1,5 ml rør og fiksér ved 4 °C.
BEMÆRK: RO'er på dag 6 og dag 18, fix 2 timer. Fastgør til 12 timer på dag 30 og 14 timer på dag 60. - Efter fiksering dehydreres ved hjælp af gradientalkohol. Lad RO'erne stå i 15 minutter hver i 50%, 60% og 70% alkohol og derefter i 10 minutter hver i 80%, 90%, 95%, 100% og 100% alkohol. Derefter tilsættes en 1:1 blanding af 100% alkohol og xylen i 10 minutter, efterfulgt af xylen to gange i 10 minutter hver.
- Placer RO'erne i metalforme fyldt med smeltet paraplast (se materialetabel) i 40 minutter, og sluk derefter formene på is for at fastgøre RO'erne. Anbring indlejrede kasser i formene og frys dem ved -20 °C natten over. Derefter skal du forsigtigt fjerne indlejringsboksene. Til sidst skal du opbevare dem på RT.
- Opret kontinuerlige sektioner (5 μm tykkelse) med en paraffinskærer. Fix skiver på vedhæftningsmikroskop dias, tør og opbevar på RT.
- Udfør afvoksning og rehydrering før antigenreparation12,27.
- Tilsæt 10 ml 20x pH 6,0 citratantigenhentningsopløsning (se materialetabel) til 190 mlddH2O(dobbeltdestilleret H2O). Opvarm i mikrobølgeovn i høj tilstand i 4 minutter, indtil det koger. Efter tilføjelse af paraffinsektioner opvarmes sektionerne i lav tilstand i 20 minutter for at fuldføre antigenreparation.
- Lad paraffinsektioner afkøle naturligt i et ventileret område, og sæt dem derefter i et fugtigt kammer.
- Brug en pappen (se Materialetabel) til at skitsere afsnittene. Inkuber med 0,2% Triton X-100 ved RT i 30 minutter for at bryde membranerne, efterfulgt af vask af diasene tre gange med TPBS i 5 minutter hver.
- Blok med 10% æselserum fortyndet i DPBS ved RT i 1 time i et fugtigt kammer med 10 μL pr. Farvningsområde.
- Tilsæt primære antistoffer fortyndet i 10% æselserum. Der inkuberes natten over ved 4 °C i et fugtighedskammer. Prøverne vaskes tre gange med TPBS i hver 10 minutter for at fjerne det ubundne antistof.
BEMÆRK: Primære antistoffer er som følger: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) og anti-NESTIN (1: 200) (se materialetabel). - Der inkuberes med sekundære antistoffer fortyndet i DPBS i 1 time ved RT i et befugtet kammer. Gentag vasketrinnet med TPBS tre gange i 10 minutter hver.
BEMÆRK: Opbevares i mørke for at forhindre slukning af det fluorescerende sekundære antistof. Sekundære antistoffer er Alexa Fluor 488 konjugeret med æsel anti-mus IgG og Alexa Fluor 568 konjugeret med æsel anti-kanin IgG ved en fortynding på 1:400 (se tabel over materialer). - Inkuber med DPBS indeholdende DAPI (1: 500; se materialetabel) i 10 minutter ved RT i mørke. Vask tre gange med TPBS i 10 minutter hver.
- Drop en passende mængde antifluorescerende forsegler (se materialetabel) på objektglasset og dæk med dæksedler.
- Visualiser ved hjælp af en flowlignende vævscellekvantitativ analysator (se materialetabel) eller lignende.
- Opbevar objektglas ved -20 °C mørkt efter mikroskopisk analyse.
- Overfør 3-5 RO'er til 1,5 ml rør. Afpipetter overskydende medium og vask RO'erne en gang med 1 ml DPBS ved RT. Lad RO'erne synke, og fjern forsigtigt DPBS. Tilsæt 1 ml 4% paraformaldehyd (se materialetabel) pr. 1,5 ml rør og fiksér ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En grafisk oversigt over den ændrede protokol er vist i figur 1. H9-ESC'er blev brugt til at generere RO'er, når cellerne blev dyrket til en tæthed på 70% -80%. Enkeltcellesuspensioner af H9-ESC i 96 V-bundede koniske brønde aggregeret på dag 1 og dannede velafgrænsede runde EB'er på dag 6. Efterhånden som kulturtiden steg, steg mængden af EB'er gradvist. På dag 30 blev neuroepitellignende strukturer tydeligt dannet og fortykket under langvarig NR-differentiering.
Desuden blev den modificerede metode sammenlignet med to andre metoder (Kuwahara et al.12 og Döpper et al.27) for at evaluere dens repeterbarhed og effektivitet (supplerende figur 1). Denne undersøgelse observerede også, at morfologien af EB'er på dag 1 efter den modificerede metode var lidt værre end i de to andre metoder. Imidlertid var de neuroepitelstrukturer, der blev dannet ved hjælp af den modificerede metode, mere kontinuerlige på dag 18 (figur 2). På dag 30 var de tidlige NR'er opnået ved hjælp af den modificerede metode ens i form og størrelse og viste en regelmæssig rund form (figur 3). Sammenlignet med de to andre metoder havde NR'erne dannet ved den modificerede metode en lavere forekomst af vesikulation og vedhæftning. Baseret på H9-ESC'erne steg succesraten for generering af NR'er ved hjælp af den modificerede metode til 87,39% fra henholdsvis 26,9% og 69,24% for Kuwahara et al.'s og Döpper et al.'s metoder 12,27 (figur 3M).
Immunofluorescensfarvning blev udført på paraffinindlejrede sektioner af NR'erne for at evaluere ekspressionen af markører relateret til retinal udvikling (figur 4). Resultaterne viste ekspression af humane gener forbundet med nethinden i NR'er afledt af H9-ESC ved hjælp af en modificeret metode. Den første celleundertype, der vises, er retinal ganglioncelle, som hovedsageligt akkumuleres på den basale side af NR'erne. TUJ1-farvning blev brugt til at identificere axonerne i retinale ganglionceller (figur 4I-L). Desuden blev markører for retinale stamceller påvist i både de indre (PAX6+) og ydre (CHX10+) lag (figur 4A-H). Celler, der var positive for proliferationsmarkøren KI67, blev fordelt i det ydre lag (figur 4A-D).
Figur 1: Skematisk oversigt. Den skematiske oversigt over den modificerede kulturprotokol viser tilføjelsen af forskellige faktorer på bestemte tidspunkter og de repræsentative billeder af den neurale nethindeudvikling. SFEBq: serumfri flydende kultur af embryoide kropslignende aggregater med hurtig reaggregering; KSR: udskiftning af knockout-serum; gfCDM: kemisk defineret vækstfaktorfrit medium; NRDM: neuralt retina-differentieringsmedium; BMP4: knoglemorfogenetisk protein 4.Skala barer: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: De repræsentative brightfield-billeder af retinale organoider stammer fra tre forskellige protokoller i det tidlige stadium. På dag 1 var det kun den modificerede metode, der ikke kom fra EB'erne (A, E, I). På dag 6 blev EB'er dannet i alle tre metoder (B, F, J). På dag 18 blev tidlige neurale nethinden dannet, og der blev fundet forskellig morfologi blandt de tre induktionsmetoder (C, G, K). På dag 21 viste neurale nethinden genereret ved den modificerede metode kontinuerlig neuroepitelstruktur (D, H, L). Vægtstænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Moden 3D neural nethinden i suspensionskultur på dag 30, 45, 60. På dag 30 dannes neurale nethinden i alle tre metoder (A, E, I). Pile angiver cystiske strukturer i Kuwahara et al.'s metode (B). Hvide stiplede kasser repræsenterer regionen af organoider, vedhæftning og fusion til hinanden (D, F, H). Retinale organoider genereret fra den modificerede protokol er ens i størrelse og morfologi sammenlignet med de to andre metoder (C, G, J, K, L). Skalastænger: 100 μm (hvid); 200 μm (sort). Statistisk diagram over induktionssuccesrate ved hjælp af de tre metoder ved hjælp af H9-ESC (M). Envejsanalyse af varians blev brugt til at teste signifikansen (fejlbjælker viser standardfejl, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af neurale nethinden i den modificerede protokol. Immunfarvningsbilleder af neurale nethinden på dag 6, dag 18, dag 30 og dag 60. Grønne pletter er til KI67 (prolifererende celle), PAX6 (retinal stamcelle) og NESTIN (neurale stamceller). Røde pletter er til CHX10 (retinal stamcelle), SOX2 (neural stamcelle) og TUJ1 (retinal ganglioncelle). Skalastænger: 100 μm (A, B, E, F, I, J); 200 μm (C,D,G,H,K,L). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Sammenligning af flowdiagrammer for de tre retinale organoide induktionsprotokoller. SFEBq: serumfri flydende kultur af embryoide kropslignende aggregater med hurtig reaggregering; KSR: udskiftning af knockout-serum; gfCDM: kemisk defineret vækstfaktorfrit medium; NRDM: neuralt retina-differentieringsmedium; BMP4: knoglemorfogenetisk protein 4. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Morfologien af embryoidlegeme (EB) induceret af Kuwaharaet al.'s metode. Den gradvise forekomst af døde celleklumper blev observeret omkring EB'er efter tilsætning af BMP4 på dag 6 (A-D, sorte pile). Store morfologiske forskelle blev observeret efter dag 6 (E-L), og nogle EB'er var endda helt inaktiverede (H,L). ESC: embryonal stamcelle, PBMC: mononukleær celle i perifert blod, IPSC: induceret pluripotent stamcelle. Skalabjælker: 200 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menneskelige RO'er kan rumligt og tidsmæssigt rekapitulere udviklingen af fosternethinden, og tidlige RO'er udviser en høj grad af lighed med fostrets nethinde på tilsvarende udviklingsstadier15. Med hensyn til vævsmorfologi og molekylær ekspression afspejler human RO nøje den faktiske vækststatus for nethindevævet, hvilket giver enorme og hidtil usete muligheder inden for sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og regenerativ medicin. I øjeblikket er der etableret flere forskellige metoder til at generere RO'er fra humane PSC'er in vitro, og løbende ændringer og optimeringer er undervejs for yderligere at forbedre effektiviteten9. Sasai-laboratoriet rapporterede for første gang om dannelsen af RO'er afledt af PSC fra humane ESC'er11. Humane ESC'er blev først forberedt til enkeltcellesuspensioner, og derefter blev lige mange celler podet i 96 V-bundede koniske brønde med hurtig aggregering til dannelse af cirkulærelignende EB'er. Den eksterne tilsætning af nøglecellesignalveje fremmede dannelsen af optiske vesikler i EB'er, som efterfølgende modnedes til laminerede RO'er i suspensionskultur. NR indeholder en gliacelletype og seks forskellige neuronale celletyper, der repræsenterer mange aspekter af retinal udvikling, såsom cellemorfogenese, neurondifferentiering og apikal-basal polaritet9. Selvom kun 10% af aggregaterne dannede en dobbeltvægget optisk kopstruktur, var dette en vigtig milepæl i udviklingen af at producere mere avancerede RO'er11.
Derefter introducerede Zhong et al. et nyt alternativ, hvor hiPSC'er først blev dyrket tæt på sammenløb, efterfulgt af kemisk eller mekanisk nedbrydning i flydende små aggregater13. Derefter dannede de små aggregater EB'er i suspensionskultur, som løsnede sig separat fra bunden af pladen og yderligere differentierede i neural retning. Zhong et al. demonstrerede en fuldstændig lamineret 3D nethinden med relativt veludviklede fotoreceptor ydre segmenter, der reagerede på lysstimulering. Denne metode krævede mindre ekstern regulering af cellesignalveje og blev primært udført på en selvstyret måde9. Den tredje teknologiske revolution var introduktionen af indlejringsmetoden af Lowe gruppe25. Dette involverede indlejring af hESC-aggregater i ECM for at danne en epitelstruktur med et enkelt lumen. Efter enzymatisk dispersion blev aggregaterne opretholdt i en suspensionskultur for at danne modne RO'er. Selvom alle tre metoder med succes kan inducere RO'er med sammenlignelig struktur og funktion, har applikationer i stor skala ulemperne ved at være tidskrævende og besværlige på grund af deres høje heterogenitet og lave succesrate23.
Ud over de ovennævnte metoder foreslog Kuwahara et al. en ny induktionsmetode, nemlig nøglefaktorgradientfaldsmetoden12. De fandt, at NR kunne genereres ved tilsætning af BMP4 ved faldende koncentration fra dag 6. Dette induktionssystem brugte færre eksterne faktorer til at danne RO'er med øget ensartethed i størrelse og morfologi. Undersøgelser har imidlertid rapporteret, at de dannede EB'er var tilbøjelige til cystiske læsioner, og induktionssuccesraten for denne metode var ca. 40%12,28. Döpper et al. ændrede denne protokol for at forbedre succesraten ved at kombinere et kommercielt medium med tre små molekylehæmmere i det tidlige stadium af induktion for at stabilisere EB'erne27. I modsætning hertil klæber celler i nethindens neurale epitel lettere til hinanden, hvilket nødvendiggør separat kultur af hver RO under langvarig suspensionskultur. Döpper et al.'s metode øger komplikationerne og omkostningerne ved eksperimentelle operationer og er ikke egnet til induktion i stor skala27. Den optimerede RO-produktionsprotokol forbedrede induktionseffektiviteten. Den nuværende modificerede metode blev sammenlignet med metoderne Kuwahara et al. og Döpper et al.
Denne undersøgelse viste, at både Kuwahara et al.'s og Döpper et al.'s metoder dannede EB'er med glatte kanter på dag 1, mens den nuværende modificerede metode krævede relativt lang tid at danne EB'er, cirka indtil dag 6. Volumenet af EB'er opnået ved hjælp af Kuwahara et al.'s metode var større end det, der blev opnået ved hjælp af Döpper et al.'s metode, og EB'erne opnået ved hjælp af Döpper et al.'s metode viste øget fluiditet under væskestrøm. Især opstod døde celleklumper gradvist omkring EB'erne efter tilsætning af BMP4 på dag 6, når Kuwahara et al.'s metode blev brugt (supplerende figur 2). På dag 18 blev der observeret signifikante morfologiske forskelle i EB'erne i Kuwahara et al.'s metode, og nogle EB'er blev fuldstændig inaktiveret (supplerende figur 2). I Döpper et al.'s metode var størstedelen af EB'erne afrundede og velafgrænsede og udviste kun et lille antal spredte døde celler omkring dem. Den modificerede metode dannede stramme og velstrukturerede EB'er med små morfologiske forskelle, og nogle få døde celler blev observeret omkring dem.
Desuden viste denne undersøgelse også, at nogle EB'er genererede vesikler af Kuwahara et al. i den tidlige fase efter overførsel til 6-brøndplader, hvilket resulterede i manglende dannelse af RO'er. Adhæsion og fusion af RO'er forekom omkring dag 40, hvilket signifikant reducerede nytten af eksperimenterne. Kultursystemet i Döpper et al.'s metode er mere kompliceret og kræver flere operationelle trin og højere omkostninger end Kuwahara et al.'s metode. Størstedelen af RO'er af Döpper et al. udviklede også uundgåeligt adhæsioner og fusioner med hinanden. Den modificerede metode i denne undersøgelse genererede med succes 3D NR'er in vitro , der udtrykte de humane nethinderelaterede markører CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 og NESTIN. Og de fleste RO'er ved den modificerede metode var konsistente i størrelse og morfologi, og meget få vesikler eller adhæsioner udviklede sig i de sene stadier af retinal differentiering.
Sammenlignet med de to andre metoder havde det nye kultursystem enklere operationelle trin og lavere omkostninger. Det kritiske trin i den modificerede metode er at tilføje tre små molekylehæmmere til medier og sikre, at pladen ikke flyttes i de første seks dage for at stabilisere strukturen af EB'er. Pladernes bevægelse eller cellemanipulation i det tidlige stadium kan påvirke dannelsen af EB'er. Sammenlignet med de to andre metoder ændrede den modificerede metode ikke mediet på dag 1 og reducerede også brugen af små molekylehæmmere på dag 15. Kort sagt forenkles driftstrinnene i den modificerede metode til en vis grad, og de eksperimentelle omkostninger spares med mindre brug af medier og reagenser. Den modificerede metode kan dog stadig ikke løse de fælles problemer i det nuværende organoidkultursystem. Derudover afhænger ROs induktionseffektivitet i høj grad af hPSC'ernes kvalitet og differentieringsevne. I denne undersøgelse blev kun effektiviteten af NR-generering ved hjælp af H9-ESC fuldstændigt beregnet. Vi inducerede med succes RO'er i forskellige hPSC-linjer med den nye metode i denne undersøgelse og opnåede den samme induktionseffektivitet, herunder H9, H1 og PBMC-iPSC. Der er ingen statistisk forskel i induktionseffektivitet mellem de tre cellelinjer. I fremtiden skal flere undersøgelser undersøge induktionseffektiviteten af forskellige hPSC'er ved hjælp af denne metode.
Afslutningsvis er den optimerede retinale induktionsprotokol enkel og billig, har høj repeterbarhed og effektivitet, tilbyder lovende personlige modeller af nethindesygdomme og giver en rigelig cellekilde til celleterapi, lægemiddelscreening og genterapitest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
