Generering av neural näthinna från humana pluripotenta stamceller
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver ett optimerat 3D-neuralt näthinneinduktionssystem som minskar vidhäftningen och sammansmältningen av näthinneorganoider med hög repeterbarhet och effektivitet.
Abstract
Retinopati är en av de främsta orsakerna till blindhet över hela världen. Att undersöka dess patogenes är avgörande för tidig diagnos och snabb behandling av retinopati. Tyvärr finns det etiska hinder som hindrar insamlingen av bevis från människor. Nyligen har många studier visat att humana pluripotenta stamceller (PSC) kan differentieras till retinala organoider (RO) med hjälp av olika induktionsprotokoll, som har en enorm potential inom retinopati för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och stamcellsbaserade terapier. Denna studie beskriver ett optimerat induktionsprotokoll för att generera neural näthinna (NR) som avsevärt minskar sannolikheten för vesikulation och fusion, vilket ökar produktionsgraden fram till dag 60. Baserat på PSC:s förmåga att självomorganisera sig efter dissociation, i kombination med vissa komplementära faktorer, kan denna nya metod specifikt driva NR-differentiering. Dessutom är tillvägagångssättet okomplicerat, kostnadseffektivt, uppvisar anmärkningsvärd repeterbarhet och effektivitet, ger uppmuntrande utsikter för personliga modeller av näthinnesjukdomar och tillhandahåller en riklig cellreservoar för applikationer som cellterapi, läkemedelsscreening och genterapitestning.
Introduction
Ögat fungerar som den primära informationskällan bland mänskliga sinnesorgan, med näthinnan som den huvudsakliga visuella sensoriska vävnaden i däggdjurs ögon1. Retinopati är en av de främsta globala orsakerna till ögonsjukdomar och leder tillblindhet. Cirka 2,85 miljoner människor världen över lider av olika grader av synnedsättning på grund av retinopati3. Följaktligen är det avgörande att undersöka dess patogenes för tidig diagnos och snabb behandling. De flesta studier på human retinopati har främst fokuserat på djurmodeller 4,5,6. Den mänskliga näthinnan är dock en komplex, flerskiktad vävnad som består av olika celltyper. Traditionella tvådimensionella (2D) cellodlings- och djurmodellsystem misslyckas vanligtvis med att troget rekapitulera den normala spatiotemporala utvecklingen och läkemedelsmetabolismen hos den inhemska mänskliga näthinnan 7,8.
På senare tid har 3D-odlingstekniker utvecklats för att generera vävnadsliknande organ från pluripotenta stamceller (PSC)9,10. Retinala organoider (RO) som genereras från humana PSC:er i ett 3D-suspensionsodlingssystem innehåller inte bara sju näthinnecelltyper utan uppvisar också en distinkt stratifierad struktur som liknar den mänskliga näthinnan in vivo 11,12,13. Humana PSC-härledda RO har vunnit popularitet och utbredd tillgänglighet och är för närvarande de bästa in vitro-modellerna för att studera utvecklingen och sjukdomen i den mänskliga näthinnan14,15. Under de senaste decennierna har många forskare visat att humana PSC, inklusive embryonala stamceller (ESC) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), kan differentiera till RO med hjälp av olika induktionsprotokoll. Dessa framsteg har en enorm potential inom retinopati för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och stamcellsbaserade terapier 16,17,18.
Genereringen av neural näthinna (NR) från humana pluripotenta stamceller (PSC) är dock en komplex, besvärlig och tidskrävande process. Dessutom kan variationer från sats till sats i vävnadsorganoider leda till lägre reproducerbarhet av resultat19,20. Många inre och yttre faktorer kan påverka utbytet av retinala organoider (RO), såsom antalet eller arten av startceller och användningen av transkriptionsfaktorer och småmolekylära föreningar 21,22,23. Sedan den första mänskliga RO genererades av Sasai-laboratoriet11 har flera modifieringar föreslagits under åren för att förbättra induktionsprocessens lätthet och effektivitet 13,21,24,25. Tyvärr har hittills inget guldstandardprotokoll upprättats för att generera RO i alla laboratorier. Det finns faktiskt en viss grad av diskrepans i RO till följd av olika induktionsmetoder, liksom stor variation i uttrycket av näthinnemarkörer och robustheten i deras struktur22,26. Dessa problem kan allvarligt komplicera provtagningen och tolkningen av studieresultaten. Därför behövs ett mer konsoliderat och robust differentieringsprotokoll för att maximera effektiviteten med minimal heterogenitet i RO-genereringen.
Denna studie beskriver ett optimerat induktionsprotokoll baserat på en kombination av Kuwahara et al.12 och Döpper et al.27 med detaljerade instruktioner. Den nya metoden minskar avsevärt sannolikheten för organoid vesikulation och fusion, vilket ökar framgångsgraden för att generera NR. Denna utveckling är mycket lovande för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och cellterapiapplikationer för näthinnesjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mänskliga RO kan rumsligt och tidsmässigt rekapitulera utvecklingen av fostrets näthinna, och tidiga RO uppvisar en hög grad av likhet med fostrets näthinna vid motsvarande utvecklingsstadier15. När det gäller vävnadsmorfologi och molekylärt uttryck speglar mänsklig RO nära näthinnans faktiska tillväxtstatus, vilket ger enorma och oöverträffade möjligheter inom sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och regenerativ medicin. För närvarande har flera olika metoder etablerats fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
