Генерация нейронной сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека
Summary
В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.
Abstract
Ретинопатия является одной из основных причин слепоты во всем мире. Исследование ее патогенеза имеет важное значение для ранней диагностики и своевременного лечения ретинопатии. К сожалению, этические барьеры препятствуют сбору доказательств от людей. Недавние многочисленные исследования показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут быть дифференцированы в органоиды сетчатки (РО) с использованием различных протоколов индукции, которые имеют огромный потенциал в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток. В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции для генерации нейронной сетчатки (NR), который значительно снижает вероятность везикуляции и слияния, увеличивая вероятность успеха продукции до 60-го дня. Основываясь на способности ПСК к самореорганизации после диссоциации, в сочетании с определенными комплементарными факторами, этот новый метод может специфически стимулировать дифференцировку NR. Кроме того, этот подход является несложным, экономически эффективным, демонстрирует значительную повторяемость и эффективность, представляет обнадеживающие перспективы для персонализированных моделей заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный резервуар клеток для таких применений, как клеточная терапия, скрининг лекарств и тестирование генной терапии.
Introduction
Глаз служит основным источником информации среди органов чувств человека, а сетчатка является основной зрительной сенсорной тканью в глазах млекопитающих1. Ретинопатия является одной из основных глобальных причин заболеваний глаз, приводящих к слепоте2. Около 2,85 миллиона человек во всем мире страдают от различных степеней нарушения зрения, вызванных ретинопатией3. Следовательно, изучение его патогенеза имеет решающее значение для ранней диагностики и своевременного лечения. Большинство исследований ретинопатии человека были в основном сосредоточены на животных моделях 4,5,6. Однако сетчатка человека представляет собой сложную, многослойную ткань, состоящую из различных типов клеток. Традиционные двумерные (2D) системы клеточных культур и животных моделей, как правило, не в состоянии точно воспроизвести нормальное пространственно-временное развитие и метаболизм лекарств в сетчатке естественного человека 7,8.
В последнее время технологии 3D-культивирования позволяют создавать тканеподобные органы из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК)9,10. Органоиды сетчатки (РО), полученные из человеческих ПСК в системе 3D-суспензионных культур, не только содержат семь типов клеток сетчатки, но и демонстрируют отчетливую стратифицированную структуру, аналогичную сетчатке человека in vivo 11,12,13. ОО, полученные из ПСХ человека, завоевали популярность и широкую доступность и в настоящее время являются лучшими моделями in vitro для изучения развития и заболевания сетчатки человека14,15. За последние несколько десятилетий многочисленные исследователи продемонстрировали, что человеческие ПСК, включая эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), могут дифференцироваться в ОО с помощью различных протоколов индукции. Эти достижения обладают огромным потенциалом в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток 16,17,18.
Однако генерация нервной сетчатки (НР) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) является сложным, громоздким и трудоемким процессом. Кроме того, вариации тканевых органоидов от партии к партии могут привести к снижению воспроизводимости результатов19,20. Многочисленные внутренние и внешние факторы могут влиять на выход органоидов сетчатки (РО), такие как количество или виды исходных клеток и использование транскрипционных факторов и низкомолекулярных соединений 21,22,23. С тех пор, как в лаборатории Сасаи был создан первый человеческий ОО11, на протяжении многих лет было предложено множество модификаций для повышения простоты и эффективности процесса индукции 13,21,24,25. К сожалению, на сегодняшний день не установлено золотого стандарта для получения ПВ во всех лабораториях. Действительно, существует определенная степень расхождения в ОК в результате различных методов индукции, а также широкий разброс экспрессии маркеров сетчатки и надежности их структуры22,26. Эти проблемы могут серьезно осложнить сбор образцов и интерпретацию результатов исследования. Таким образом, необходим более консолидированный и надежный протокол дифференциации для достижения максимальной эффективности при минимальной гетерогенности генерации обратного осмоса.
В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции, основанный на комбинации Kuwahara et al.12 и Döpper et al.27 с подробными инструкциями. Новый метод значительно снижает вероятность органоидной везикуляции и слияния, повышая успешность генерации НР. Эта разработка имеет большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и клеточной терапии при заболеваниях сетчатки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Человеческие ОР могут пространственно и во времени повторять развитие сетчатки плода, а ранние ОР демонстрируют высокую степень сходства с сетчаткой плода на эквивалентных стадиях развития15. С точки зрения морфологии тканей и молекулярной экспрессии, человеческий обрат?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
